發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)及發(fā)酵工程總結(jié)

實(shí)驗(yàn)一酸奶的制作與乳酸菌的活菌計(jì)數(shù)（5學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)并掌握酸奶制作的基本原理與方法。2、了解市售酸奶的生產(chǎn)工藝。3、掌握乳酸菌活菌計(jì)數(shù)方法與操作。實(shí)驗(yàn)原理：乳酸菌在乳中生長繁殖，發(fā)酵分解乳糖產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等電點(diǎn)附近發(fā)生凝集。乳酸菌屬于兼性厭氧微生物，在無氧條件下生長繁殖較好，實(shí)驗(yàn)室條件下利用混菌培養(yǎng)的方法，盡可能讓乳酸菌在無氧條件下生長，每個(gè)單菌落代表一個(gè)微生物細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：（一）酸奶制作1、10%脫脂奶粉溶解于熱水（80℃2、添加蔗糖：為了緩和酸奶的酸味，改善酸奶口味，在調(diào)制乳中加人4-8％的蔗糖。3、滅菌：方法有兩種：將乳加熱至90℃，保溫5min4、接種：往冷卻到43-45℃滅過菌的乳中加入乳酸菌，接種量為2%-5%5、分裝：酸奶受到振動(dòng)，乳凝狀態(tài)易被破壞，因此，不能在發(fā)酵罐容器中先發(fā)酵然后再進(jìn)行分裝，須是將含有乳酸菌的牛乳培養(yǎng)基先分裝到小容器中，加蓋后送入恒溫室培養(yǎng)，在小容器中發(fā)酵制成酸奶。6、發(fā)酵：發(fā)酵的溫度保持在40-43℃，一般發(fā)酵時(shí)間為3-6h發(fā)酵終點(diǎn)的確定有兩種方法：1）檢測發(fā)酵奶的酸度，達(dá)到65-70T°。2）傾斜觀察，瓶內(nèi)酸奶流動(dòng)性差，而且瓶中部有細(xì)微顆粒出現(xiàn)。7、冷卻：發(fā)酵結(jié)束，將酸奶從發(fā)酵室取出，用冷風(fēng)迅速將其冷印到10℃以下，一般2h8、冷藏和后熟：經(jīng)冷卻處理的酸奶，貯藏在2-5℃9、感官指標(biāo)1）色澤：色澤均勻一致，呈乳白色，或稍帶微黃色。2）組織狀態(tài)：凝塊稠密結(jié)實(shí)均勻細(xì)膩，無氣泡，允許少量乳清析出。3）氣味：具有清香純凈的乳酸味，無酒精發(fā)酵味，無霉味和其他外來不良?xì)馕?。（二）乳酸菌活菌檢測①、檢測培養(yǎng)基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化鈉5g，碳酸鈣10g，瓊脂粉20g，水1000ml，115～121℃滅菌20min，滅菌后放置水浴52℃保溫備用。②、稀釋：取10克樣品放入添加90ml無菌水的帶4-6顆玻璃珠的250ml三角瓶中，搖床180rpm震蕩30min，即為10－1樣品溶液；再從中取1ml至添加9.0ml無菌生理鹽水三角瓶中，稀釋至10－2，以此類推稀釋至10－8，即稀釋了1億倍;③、倒培養(yǎng)平板，從上述已稀釋了1億倍的乳酸菌懸液中取1ml，在無菌操作臺(tái)上注入9.0cm培養(yǎng)皿中，再將已經(jīng)滅了菌的保持在52℃水浴鍋中的呈溶解狀態(tài)的培養(yǎng)基，倒入15毫升左右于培養(yǎng)皿中，全部浸到培養(yǎng)皿，與菌懸液充分混合均勻（倒入培養(yǎng)基后，馬上用手轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)動(dòng)幾下，讓其混合均勻），然后等其凝固再移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，注意最后一步倒平皿必須在超凈臺(tái)無菌操作，以免雜菌污染。每次稀釋均要換滅好菌的移液管。④、培養(yǎng)條件：37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72h。⑤、培養(yǎng)完畢后，取出進(jìn)行計(jì)數(shù)，因?yàn)槭窍♂屃?億倍，所以一個(gè)透明圈菌落代表1億/克，如果有200個(gè)透明圈，則是200億/克。實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：市售酸奶試劑：白糖奶粉培養(yǎng)基各成分器材：培養(yǎng)箱、電爐、鋁鍋5L，培養(yǎng)皿，酸奶發(fā)酵瓶（自帶）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：詳細(xì)描述自己制作的酸奶結(jié)果：答：制作后酸奶與市場所售酸奶比較，比市場所售酸奶更稠密，酸奶的香味與酸味明顯，制作成功記錄個(gè)人酸奶中各菌數(shù)測定的平行數(shù)據(jù)，計(jì)算最終平均值。答：最終培養(yǎng)基上未出現(xiàn)乳酸菌菌落，全部為雜菌菌落，因此無法統(tǒng)計(jì)酸奶中的菌含量同時(shí)用圖片記錄實(shí)驗(yàn)過程中各現(xiàn)象與結(jié)果并對(duì)圖進(jìn)行注釋。答：制備乳酸菌時(shí)，瓶子上方留有一部分空間，并未使乳酸菌完全處于無氧環(huán)境中發(fā)酵，但乳酸菌是兼性厭氧菌，因此在存在少量氧氣的環(huán)境中，乳酸菌也可以生長，酸奶制備成功。但在平板接種時(shí)，由于污染雜菌，乳酸菌并未長出。乳酸菌計(jì)數(shù)失敗。思考題：乳酸菌的保藏通常為低溫條件，這給運(yùn)輸、保藏帶來很大的成本，請(qǐng)問可采用什么方法使乳酸菌在常溫條件下有很高的存活率？答：在基因水平上對(duì)乳酸菌進(jìn)行基因重組，從而獲得耐高溫乳酸菌。在基因庫里篩選抗高溫的基因并利用基因重組技術(shù)將其重組在乳酸菌基因上，對(duì)乳酸菌的基因進(jìn)行修飾使其表達(dá)，以此來獲得耐高溫菌株。實(shí)驗(yàn)二枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵及活菌數(shù)測定（5學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)了解固態(tài)發(fā)酵原理；2、以枯草芽孢桿菌為對(duì)象，了解固態(tài)發(fā)酵的控制技術(shù)；3、掌握枯草芽孢桿菌活菌計(jì)數(shù)方法與操作。實(shí)驗(yàn)原理：作為抗生素的替代品，益生菌和酶制劑等的研究與開發(fā)近幾年成為綠色飼料添加劑的熱點(diǎn)，其中益生菌倍受關(guān)注。作為益生菌的一種，芽孢桿菌制劑在動(dòng)物生產(chǎn)中的研究和應(yīng)用一直都是畜牧業(yè)科研和生產(chǎn)人員關(guān)注的焦點(diǎn)。目前芽孢桿菌多采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，再經(jīng)噴霧干燥進(jìn)行生產(chǎn)，對(duì)設(shè)備要求高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜；而固體發(fā)酵采用的原料一般是廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品(如草粉、麩皮等)，采用的設(shè)備也較液體發(fā)酵簡單，生產(chǎn)成本大大低于液體發(fā)酵。所以近年來各生產(chǎn)廠家都在積極探索芽孢桿菌的固體發(fā)酵技術(shù)，以求簡化生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。固態(tài)發(fā)酵定義：指沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度的水不溶性固態(tài)基質(zhì)中，培養(yǎng)一種或多種微生物的生物反應(yīng)過程，是以氣相為連續(xù)相的生物反應(yīng)過程?？莶菅挎邨U菌屬于好氧微生物，實(shí)驗(yàn)室條件下利用稀釋涂布培養(yǎng)的方法，讓菌在有氧條件下生長，每個(gè)單菌落代表一個(gè)微生物細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、液體種子培養(yǎng)基配制：葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，pH7.0。2、液體種子培養(yǎng)：每300mL三角瓶裝量50mL液體種子培養(yǎng)基，在115℃條件下滅菌30min。降溫后從斜面接一環(huán)菌苔至種子培養(yǎng)基。置37℃控溫?fù)u床培養(yǎng)。轉(zhuǎn)速200r·min-1，至芽孢率達(dá)90%以上時(shí)停止，約需24h。3、固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮60%，稻草粉10%，玉米粉5%，豆粕25%，硫酸鎂0.05%，硫酸銨0.5%，料水比為1:1.1。4、三角瓶固體發(fā)酵培養(yǎng)：每250mL三角瓶裝量20-30g（濕重），固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料試劑混合料，加水，料水比為1:1.1，攪拌均勻，培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌30min，降溫后接種量為2%(V/M：V—液體菌種體積數(shù)，M—固體發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量)，然后置37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，間時(shí)拍打，使其均勻生長。至脫落芽孢率為80%以上時(shí)，停止發(fā)酵，約需48h。（二）枯草芽孢菌活菌檢測①、檢測培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，瓊脂粉2%，pH7.0。115℃滅菌20min，滅菌后放置水浴52℃保溫備用。②、稀釋：取10克樣品放入添加90ml無菌水的帶玻璃珠的250ml三角瓶中，搖床180rpm震蕩30min，即為10－1樣品溶液；再從中取1ml至添加9.0ml無菌生理鹽水的三角瓶中，稀釋至10－2，……以此類推稀釋至10－8，即稀釋了1億倍;③、倒培養(yǎng)平板，將已經(jīng)滅了菌的保持在52℃水浴鍋中的呈溶解狀態(tài)的培養(yǎng)基，倒入15毫升左右于培養(yǎng)皿中，全部浸到培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固；從上述已稀釋了1億倍的菌懸液中取0.2ml于已凝固的培養(yǎng)基表面，用玻璃刮鏟涂布均勻，靜止10min，然后再移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。④、培養(yǎng)條件：37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h；⑤、培養(yǎng)完畢后，取出進(jìn)行計(jì)數(shù)。（三）芽孢率測定:采用芽孢革蘭氏染色后顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：枯草芽孢桿菌試劑：培養(yǎng)基成分器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋，培養(yǎng)皿實(shí)驗(yàn)結(jié)果：詳細(xì)描述枯草芽孢桿菌固態(tài)培養(yǎng)物（外觀、氣味、培養(yǎng)物狀態(tài)等）：答：枯草芽孢桿菌淡黃色，中間色深，表面較平整，無光澤，邊緣不整齊，形成的菌落為圓形。培養(yǎng)基中的枯草芽孢桿菌有腥臭味，長勢良好，觀察培養(yǎng)基，無明顯染菌現(xiàn)象。記錄活菌測定中各平行數(shù)據(jù)，計(jì)算最終平均值。答：數(shù)量稀釋倍數(shù)密度（/g）第一個(gè)平板1125×1075.6×109第二個(gè)平板655×1073.25×109第三個(gè)平板225×1071.1×109平均值3.32×1093、同時(shí)用圖片記錄實(shí)驗(yàn)過程中各現(xiàn)象與結(jié)果，并對(duì)圖進(jìn)行注釋。菌落成白色，菌落表面有褶皺思考題：在枯草芽孢桿菌固態(tài)生產(chǎn)過程中，為了防止霉菌與酵母的污染，可如何進(jìn)行操作？答：加入抗真菌抑制劑實(shí)驗(yàn)三、淀粉糖化與酒精發(fā)酵（5學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)類型：綜合性實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?．了解酒精發(fā)酵的主要類型、工藝原理及其控制條件2．熟悉酒精生產(chǎn)的工藝流程、掌握酒精發(fā)酵的操作方法3.掌握用酶法從淀粉原料到水解糖的制備原理及方法4.掌握在實(shí)驗(yàn)室中模擬酒精發(fā)酵的工藝流程實(shí)驗(yàn)原理玉米粉、大米粉中可供發(fā)酵的物質(zhì)主要是淀粉，而釀酒酵母由于缺乏相應(yīng)的酶，所以不能直接利用淀粉進(jìn)行酒精發(fā)酵，因此必須對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理，包括蒸煮（液化）、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破壞細(xì)胞，形成均一的醪液，能更好的接受糖化酶的作用，并轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，以便酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵。在無氧條件下酵母菌利用可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳的作用，稱為酒精發(fā)酵，是生產(chǎn)酒精及各種酒類的基礎(chǔ)，可通過測定發(fā)酵過程中產(chǎn)生CO2的量和最終產(chǎn)物酒精的量得知酵母的發(fā)酵能力。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、原料的粉碎將玉米、大米用粉碎機(jī)粉碎，玉米淀粉含量為70%，大米淀粉含量為75%。2、蒸煮糊化稱取一定量的粉碎后淀粉質(zhì)原料，按一定的料水比（100g：200ml），調(diào)制淀粉乳，90-100℃條件下恒溫水浴加熱，淀粉乳受熱后，在一定溫度范圍，淀粉粒開始破壞，晶體結(jié)構(gòu)消失，體積膨大，粘度急劇上升，呈粘稠的糊狀，即成為非結(jié)晶性的淀粉。3、糖化經(jīng)蒸煮糊化后的醪液，經(jīng)過淀粉酶的糖化作用，將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，供酵母利用。酶參考用量：淀粉乳33%，60℃，ph4.5，酶240U/g絕干淀粉，糖化時(shí)間16h。糊化醪液調(diào)整pH4.5，往其中加入一定量的淀粉酶（120U/g）、糖化酶（120U/g），60℃恒溫下不斷攪拌，直至粘度下降到一定程度，淀粉完全糖化4、發(fā)酵（1）干酵母活化將干酵母按1:20的比例投放于37℃的溫水中復(fù)水20min。目的：恢復(fù)酵母細(xì)胞的正常功能。（2）淀粉醪液糖化后，取400ml上清液于潔凈的大可樂瓶中，加相同體積的水稀釋，加入活化好的酵母種液5ml，混勻，28度培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)36h左右。5、二氧化碳生成的檢驗(yàn)（1）觀察三角瓶中的發(fā)酵液有無氣泡溢出；（2）滴入10%氫氧化鈉1ml于發(fā)酵液試管中，觀察，如氣體逐漸消失，則說明有二氧化碳的存在；6、二氧化碳生產(chǎn)量的測定（1）接種完，擦干瓶外壁，于天平上稱量，記為W1;（2）實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取出瓶輕輕搖動(dòng)，使二氧化碳盡量溢出，在同一天平上稱量，記為W2；（3）二氧化碳生成量=W1-W27、酒精生成的檢驗(yàn)（1）打開瓶塞，嗅聞?dòng)袩o酒精氣味；（2）取發(fā)酵液5ml，加10%硫酸2ml；（3）再加入1%K2Cr2O7溶液10-20滴，如顏色由黃色變?yōu)辄S綠色說明有酒精產(chǎn)生。K2Cr2O7+H2SO4+CH3CH2OH——CH3COOH+K2SO4+Cr2（SO4）3實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：活性干酵母試劑：培養(yǎng)基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可樂瓶溶液：10%H2SO4、1%K2Cr2O7、10%NaOH器材：試管、培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、水浴鍋、粉碎機(jī)、離心機(jī)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)過程中各參數(shù)及數(shù)據(jù)。淀粉淀粉酶CaCl2糖化酶100g10g0.17g2.5g2.對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷與分析。答:1二氧化碳生成的檢驗(yàn)培養(yǎng)約48h后，觀察瓶中混合液，淀粉大部分沉降在瓶底，上清濃度較稀，靠瓶壁邊緣有一連串微小氣泡2酒精生成的檢驗(yàn)打開瓶塞，聞到有濃重酒精氣味。取發(fā)酵液5ml,加10%硫酸2ml,加1%K2Cr2O7溶液10-20滴，顏色由黃色變?yōu)辄S綠色，稍加熱后現(xiàn)象產(chǎn)生更快，更明顯。思考題：現(xiàn)有3株不同來源的酒精酵母，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)與本實(shí)驗(yàn)操作不同的實(shí)驗(yàn)，判斷哪株酵母發(fā)酵酒精能力最強(qiáng)？答：按實(shí)驗(yàn)步驟配制等量的三組醪液，加入等量糖化酶進(jìn)行糖化作用，將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，向三組糖化后的淀粉上清中加入等量3株不同來源的酒精酵母種液，相同條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，分別測定三組實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的CO2的質(zhì)量，進(jìn)行比較。產(chǎn)CO2越多表示發(fā)酵酒精能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)四黑曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶及酶解底物反應(yīng)（5學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)酶情況2、掌握微生物固體發(fā)酵操作技術(shù)3、了解纖維素酶提取方法及酶活性定性測定方法實(shí)驗(yàn)原理：纖維素酶是降解纖維素的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶系，屬于誘導(dǎo)酶，其產(chǎn)生需要纖維素類物質(zhì)的誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)中以米曲霉為發(fā)酵菌株，稻草作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、黑曲霉菌種活化（1）配制PDA培養(yǎng)基：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過濾，再加20g葡萄糖和20g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管約5-10ml（視試管大小而定），15磅蒸氣（121℃）滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆?。?）在無菌超凈臺(tái)上接種保藏的黑曲霉于PDA斜面，28℃培養(yǎng)5-7天，斜面上長滿孢子。2、配制發(fā)酵培養(yǎng)基：15g麩皮+10g稻草粉，0.5%KH2PO4，0.5%(NH4)2SO4，加15ml水（加水量40%～60%），拌勻，裝瓶；3、滅菌：121℃滅菌30min，冷卻至室溫。4、黑曲霉孢子懸浮液制備已培養(yǎng)好的黑曲霉孢子斜面一支，加入約10ml無菌水，洗下孢子，制成孢子懸液。5、接種：用移液管在無菌條件下吸取一定量的懸液，移入滅菌好的固體培養(yǎng)基中，于30度條件下培養(yǎng)96h，期間每隔12h搖動(dòng)三角瓶一次。6、提取粗酶液向瓶中加入無菌水約50ml，浸泡固體曲30min-1h；過濾得粗酶液。7、酶活性測定（1）配制1%CMC底物平板：配方：1g羧甲基纖維素鈉，1.8g瓊脂，100ml，瓊脂完全溶解后，加入0.03g曲利本藍(lán)，倒平板，每皿約15ml。（2）打孔：打孔器經(jīng)酒精燃燒滅菌后，每平板打4孔，并在酒精燈火焰上稍稍加熱打孔處，使孔周圍的培養(yǎng)基微融，然后平放冷卻。（3）加樣：往孔內(nèi)加入粗酶液適量（約100ul），同時(shí)需設(shè)對(duì)照。（4）培養(yǎng)（反應(yīng)）：將加樣后的平板小心平端放入30℃培養(yǎng)箱，放置20小時(shí)左右。（5）觀察結(jié)果：可直接觀察透明圈有無、測定透明圈直徑。實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：黑曲霉試劑：土豆、稻草、麩皮、硫酸銨、羧甲基纖維素鈉（CMC）器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、離心機(jī)、天平、三角瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果：仔細(xì)觀察固體培養(yǎng)基發(fā)酵前后的狀態(tài)，并描述；答：固體培養(yǎng)基發(fā)酵前：培養(yǎng)基顏色較淺，各成分（麩皮、稻草）新鮮，粘度大成團(tuán)狀固體培養(yǎng)基發(fā)酵后：培養(yǎng)基中產(chǎn)生較多黑色孢子及菌體，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分被利用，體積縮小仔細(xì)觀察底物平板酶解前后的現(xiàn)象，并測量水解圈大小?，F(xiàn)象：紙片周圍出現(xiàn)淺淺的水解圈，打孔培養(yǎng)基未出現(xiàn)水解圈，紙片直徑2.5cm，水解圈3cm，直徑比5:6思考題：纖維素是自然界最豐富的資源，從理論角度分析如何最大限度地通過酶法利用該資源？而現(xiàn)實(shí)存在什么問題？目前對(duì)纖維素降解有哪些研究進(jìn)展？答：要想最大限度的利用纖維素，可從兩個(gè)方面入手。一是通過生產(chǎn)高性能纖維素酶的方法，二是找到蘊(yùn)含能量較高的纖維素。而現(xiàn)實(shí)中存在的問題是高性能纖維素酶的獲取，而可以通過誘變和篩選獲得可產(chǎn)生纖維素酶的新菌株。目前在纖維素的降解方面，微生物的研究較多，降解纖維素的真菌有很多，如木霉屬、青霉屬、曲霉屬、根霉屬、漆斑霉屬、枝頂孢霉屬、毛殼霉屬和脈孢霉屬等。其中，很多纖維素降解真菌在生長過程中能產(chǎn)生菌絲，

菌絲具有很強(qiáng)的穿透能力，能穿透植物角質(zhì)層的阻礙，緊緊依附和穿插在纖維物質(zhì)上，

增大降解酶與纖維物質(zhì)的接觸面積，從而加快降解速率。如木霉屬、青霉屬、漆斑霉屬、毛殼霉屬和脈抱霉屬為絲狀真菌。目前，木霉屬是迄今所知纖維素酶系最全面和研究較多的一個(gè)屬。實(shí)驗(yàn)五甘露聚糖酶液體發(fā)酵及酶解反應(yīng)（6學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私獠⒄莆找后w發(fā)酵產(chǎn)酶操作及酶反應(yīng)條件的控制與固體發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行比較分析實(shí)驗(yàn)原理甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，其主鏈?zhǔn)怯蛇拎事短菤埢?,4-β-D糖苷鍵連接而成。當(dāng)主鏈的某些殘基被葡萄糖取代，或半乳糖通過1,6-α-糖苷鍵與甘露糖殘基相連形成分枝，則稱之為異甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖。甘露聚糖是半纖維素的第二大組分，在自然界中分布廣泛，且多以異甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少見。β-甘露聚糖酶以內(nèi)切方式降解甘露聚糖主鏈產(chǎn)生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶。甘露聚糖酶可廣泛應(yīng)用于食品、造紙、紡織印染等行業(yè)。利用β-甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。在紙漿制造業(yè)，可用于代替堿法進(jìn)行脫色、漂白。在紡織印染方面，利用β-甘露聚糖酶與其它酶聯(lián)合作用，能有效去除產(chǎn)品上粘附的多余染料，降低能耗和對(duì)環(huán)境的污染等。甘露聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)將在許多行業(yè)產(chǎn)生很大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。因此，近年來甘露聚糖酶逐漸成為國內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點(diǎn)之一。甘露聚糖酶是一種半纖維素酶，其產(chǎn)生需要一定的誘導(dǎo)物存在。本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌為菌株，以魔芋粉為誘導(dǎo)物。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容菌種活化（1）配制LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L，待瓊脂充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管約5-10ml（視試管大小而定），15磅蒸氣（121℃）滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆?。?）在無菌超凈臺(tái)上接種保藏的枯草芽孢桿菌于LB斜面，28℃培養(yǎng)2天。配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，魔芋粉30g/L，以10%的體積量分裝于三角瓶中（25ml液體培養(yǎng)基/250ml三角瓶），121℃滅菌20分鐘；菌懸液的制備已培養(yǎng)好的枯草桿菌斜面一支，加入約10ml無菌水，洗下菌體，制成菌懸液。接種用移液管在無菌條件下吸取一定量的懸液，移入滅菌好的固體培養(yǎng)基中，于37度200rpm條件下培養(yǎng)72h。粗酶液提取：3000rpm離心收集得到粗酶液酶解底物分析：準(zhǔn)備兩三角瓶，分別加入50ml自來水，46度水浴保溫往兩三角瓶中各加入1g魔芋粉，然后其中一個(gè)加入粗酶液1ml，另一個(gè)加入1ml蒸餾水（做空白對(duì)照）。以后每隔5-10min往兩三角瓶中各加入1g魔芋粉，前后共加5g酶解反應(yīng)30-60min，期間觀察反應(yīng)現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：枯草芽孢桿菌試劑：蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、魔芋粉器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、離心機(jī)、天平、三角瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果：仔細(xì)觀察液體培養(yǎng)基發(fā)酵前后的狀態(tài)，并描述；答：①發(fā)酵之前的液體培養(yǎng)基的狀態(tài)：在配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基時(shí)，魔芋粉難溶解，依舊是固體顆粒。等完全滅完菌后，放正在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，等冷卻后，狀態(tài)比較像固體培養(yǎng)基，但魔芋粉依舊不溶解，其顆粒均勻地分布于培養(yǎng)基中。②經(jīng)過三天的培養(yǎng)之后，產(chǎn)酶培養(yǎng)基被液化，得到的是含有粗酶液的液體培養(yǎng)基，完全呈黃褐色的液體狀仔細(xì)觀察底物水解前后的現(xiàn)象。答：對(duì)照組：魔芋粉結(jié)成團(tuán)，透明，具有彈性，黏度很大，無法攪拌，實(shí)驗(yàn)難以繼續(xù)。實(shí)驗(yàn)組：魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全是液體狀的酶解產(chǎn)物，溶液呈透明狀。思考題：以本人液體發(fā)酵產(chǎn)酶為例，請(qǐng)?jiān)敿?xì)介紹甘露聚糖酶定量測定的原理與方法。答：原理：樣品中的甘露聚糖酶對(duì)底物－半乳甘露聚糖進(jìn)行水解，用DNS試劑（3,5-二硝基水楊酸）分光光度法測定水解所產(chǎn)生的還原糖量。方法：別向2支試管中加入1.8mL底物溶液，置50℃水浴中保溫5min。在其中一支試管中加入200μL稀釋酶樣，磁力旋轉(zhuǎn)攪拌均勻，置于50℃水浴中準(zhǔn)確保溫5min。加入3.0mLDNS試劑至兩支試管中，攪拌均勻。在另一支試管（空白管）中加入200μL稀釋酶樣，同時(shí)將兩支試管放入沸水浴中準(zhǔn)確保溫5min，取出置入冷水中冷卻至室溫。于540nm處測量酶樣對(duì)空白的吸光度，在酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取酶活，再乘以酶樣稀釋倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)六從土壤中分離篩選產(chǎn)抗生素放線菌及抗菌譜分析實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、從土壤中分離產(chǎn)抗生素的放線菌。2、抗生素產(chǎn)生菌的抗菌譜測定。3、掌握微生物的基本操作。實(shí)驗(yàn)原理：放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中，其數(shù)量僅次于細(xì)菌，一般在中性偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來，從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù)放線菌的營養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基或有機(jī)氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預(yù)先處理（120℃熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴10%酚等），都可以使細(xì)菌（本實(shí)驗(yàn)加入重鉻酸鉀150㎎／L），霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨(dú)菌落，并可得到純菌株。放線菌可以產(chǎn)生抗生素，抑制其他菌種的生長，挑取純菌落進(jìn)行抗菌譜分析，指示菌為大腸桿菌（G-）和枯草芽孢桿菌（G+）。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、高氏一號(hào)培養(yǎng)基的制備可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4?3H2O0.5g，MgSO4?7H2O0.5g，F(xiàn)eSO4?7H2O0.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.4。配制時(shí)，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分至1000ml。112℃滅菌20分鐘（實(shí)驗(yàn)中所用無菌器具均在此時(shí)滅菌）。2、土壤取樣及其懸液梯度稀釋選定取樣點(diǎn)（最好是有機(jī)質(zhì)含量高的菜地），按對(duì)角交叉（五點(diǎn)法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。盛土的容器應(yīng)是無菌的。將5點(diǎn)樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等，土樣取回后應(yīng)盡快投入實(shí)驗(yàn)。3、稱土樣10g于盛有90mL無菌水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10～20min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-1濃度的菌懸液，靜置30s。另取裝有9ml無菌水的試管4支，編號(hào)10-2、10-3、10-4、10-5。用無菌吸管無菌操作取10-1濃度的土壤懸液1ml并加入編號(hào)10-2的無菌試管中，并吹吸吸管3~4次，使與9ml水混勻，即為10-2濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-5的試管中（每個(gè)稀釋度換1支無菌吸管）。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進(jìn)行。4、稀釋倒平板法分離土壤中放線菌取3支1毫升移液管分別從10-3、10-4、10-5菌懸液中吸取1毫升菌懸液，分別注入編號(hào)10-3、10-4、10-5的培養(yǎng)皿內(nèi)，每一梯度兩個(gè)平板。將溫度為45～50℃的高氏一號(hào)培養(yǎng)基倒入上述各培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（28℃左右）培養(yǎng)一周，每天觀察培養(yǎng)基表面有無微生物菌落。將平皿上的放線菌菌落挑取在淀粉瓊脂平皿上四區(qū)劃線進(jìn)行分離純化，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右，觀察放線菌菌落特征。5、抗菌譜測定：（1）配制LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L。滅菌后倒平板。（2）將搖床培養(yǎng)12h的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別涂布于固態(tài)LB培養(yǎng)基，靜置10min。（3）挖取一個(gè)放線菌菌落（含培養(yǎng)基），倒置于平板分區(qū)的中央，培養(yǎng)一天后，觀察并測量抑菌圈大小。實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌試劑：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂、可溶性淀粉、硝酸鉀、氯化鈉、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、酒精、土壤器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、天平、三角瓶、試管、棉塞、涂布棒、接種環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1描述分離到的放線菌培養(yǎng)特征；放線菌表面光滑，顏色各異，黃，黑，褐，白，橙色，菌落較小。2觀察并測量對(duì)指示菌的抑菌圈大小?？莶菅堪麠U菌沒有抑菌圈，大腸桿菌基本都有抑菌圈，菌圈直徑0.8cm，抑菌圈直徑小的0.93cm，大的1.3cm。思考題：以某一抗生素為例，描述其工業(yè)生產(chǎn)操作。1.制備孢子2.斜面接種3.接種到大米上，產(chǎn)生米孢子4.將米孢子接種到一級(jí)種子罐5.接種到二級(jí)種子罐6.接種到發(fā)酵罐7.預(yù)處理罐8.過濾器9.萃取器10.蒸發(fā)器11.結(jié)晶器12.工業(yè)鹽1緒論1-1何謂發(fā)酵？生物化學(xué)和工業(yè)上的發(fā)酵有何不同？生物化學(xué)意義上的發(fā)酵是指細(xì)胞在無氧條件下，分解葡萄糖或有機(jī)物產(chǎn)生能量的過程。工業(yè)意義上的發(fā)酵是泛指利用培養(yǎng)細(xì)胞（包括動(dòng)物、植物和微生物）獲得產(chǎn)物的任何有氧或無氧的過程。1-2何謂發(fā)酵工程？其主要內(nèi)容是什么？請(qǐng)簡述其與生物技術(shù)的關(guān)系。發(fā)酵工程是利用生物體為工業(yè)化生產(chǎn)服務(wù)的一門工程技術(shù)，即利用生物體的生命活動(dòng)產(chǎn)生的酶，對(duì)無機(jī)或有機(jī)原料進(jìn)行酶加工（生物反應(yīng)過程），獲得產(chǎn)品的工程化技術(shù)。它是研究生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的一門學(xué)科，其主體包括生物反應(yīng)工程和產(chǎn)品提取、精制的下游工程。主要研究內(nèi)容：1）優(yōu)良菌種的選育；2）合適的生物反應(yīng)工程包括生物反應(yīng)過程的優(yōu)化、反應(yīng)器的選擇和下游工程生物技術(shù)是應(yīng)用自然科學(xué)和工程學(xué)的原理，依靠生物催化劑（酶或細(xì)胞）的作用將物料進(jìn)行加工以提供產(chǎn)品或?yàn)樯鐣?huì)服務(wù)的技術(shù)。它包括基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶工程、生化工程等五大工程。生物技術(shù)的核心是基因工程，但又離不開發(fā)酵工程。發(fā)酵工程是基因工程和酶工程的表達(dá)，即大部分生物工程的產(chǎn)品均要通過發(fā)酵工程來完成。所以說，發(fā)酵工程在生物工程中是最關(guān)鍵的過程。現(xiàn)代發(fā)酵工程處于生物技術(shù)的中心地位，絕大多數(shù)生物技術(shù)的目標(biāo)都是通過發(fā)酵工程來實(shí)現(xiàn)的。因此生物技術(shù)的主要應(yīng)用領(lǐng)域往往就是發(fā)酵工程的研究對(duì)象。1-3請(qǐng)簡述發(fā)酵工程的發(fā)展史。1）基因工程出現(xiàn)之前的時(shí)代（1982年前）；1859年發(fā)現(xiàn)發(fā)酵原理、設(shè)計(jì)了便于滅菌的密閉式發(fā)酵罐；1929,1940年發(fā)現(xiàn)和分離出青霉素，青霉素發(fā)酵、將通氣攪拌引入發(fā)酵工業(yè)；1956年谷氨酸等氨基酸、核苷酸等發(fā)酵成功、代謝控制育種理論的建立；60年代采用烷烴、乙酸、天然氣等為原料的石油發(fā)酵；2）基因工程出現(xiàn)后的時(shí)代（1982年后）。80年代隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們可定向選育高產(chǎn)菌株；1991年綜述代謝工程，在對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上開始運(yùn)用基因工程技術(shù)改造細(xì)胞代謝途徑，以改進(jìn)細(xì)胞性能或提高產(chǎn)物生產(chǎn)能力。組學(xué)的發(fā)展……系統(tǒng)工程和合成生物學(xué)……1-4何謂初級(jí)代謝和次生代謝？舉例說明初級(jí)代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物。初級(jí)代謝：微生物從外界吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)，通過分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動(dòng)的物質(zhì)和能量的過程稱為初級(jí)代謝。常見的初級(jí)代謝產(chǎn)物有：乙醇、氨基酸、呈味核苷酸、有機(jī)酸、多羥基化合物、多糖（黃原膠、結(jié)冷膠）、糖類和維生素。次生代謝：是相對(duì)于初級(jí)代謝而言的一個(gè)概念。它是指微生物在一定的生長時(shí)期，以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對(duì)微生物的生命活動(dòng)無必要功能的物質(zhì)的過程。次生代謝產(chǎn)物大都是分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物。根據(jù)其作用，可將其分為抗生素、激素、生物堿、酶和毒素。3滅菌3-1滅菌的方法有哪幾種？化學(xué)藥劑滅菌（過氧乙酸、次氯酸鈉、二氧化氯、甲醛、過氧乙酸、環(huán)氧乙烷……）射線滅菌（紫外線、高能電磁波、放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子）干熱滅菌（160°C，1h；主要由于氧化作用而死亡：微波加熱滅菌、烘箱加熱滅菌）濕熱滅菌（120°C，30min；利用飽和蒸汽滅菌）過濾除菌（空氣除菌、料液的過濾除菌）3-2何謂空消和實(shí)消？各自操作如何？空消：培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌時(shí)，發(fā)酵罐需在培養(yǎng)基滅菌前直接通蒸汽進(jìn)行空罐滅菌（進(jìn)汽→關(guān)閥升壓→保壓30min→降壓后通入無菌空氣→冷卻）；實(shí)消：實(shí)罐滅菌，即分批滅菌，將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其它裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用裝置一起進(jìn)行滅菌。3-3連續(xù)滅菌流程有哪幾種？各自的特點(diǎn)是什么？連消塔—噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程：由連消泵、連消塔、維持罐和噴淋冷卻器組成薄板換熱器連續(xù)滅菌流程：由3個(gè)薄板換熱器、維持管組成，節(jié)約了蒸汽和冷卻水噴射加熱連續(xù)滅菌流程：由噴射加熱器、維持管、膨脹閥和真空冷卻器組成3-4簡述發(fā)酵用無菌空氣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。1.?連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣，VVM=0.1-2.0；2.?空氣的壓力一般為0.2-0.4Mpa;3.?進(jìn)入過濾器前空氣的相對(duì)濕度≤70%；4.?進(jìn)入發(fā)酵罐的空氣溫度可比培養(yǎng)溫度高10-30°C;5.?過濾后空氣的無菌程度為10-3。3-5空氣過濾除菌流程一般包括哪幾部分？各自的作用是什么？粗過濾器【去除大顆粒塵埃，粗過濾器分為布袋過濾器、油浴洗滌和水霧除塵器3種】→空氣壓縮機(jī)【供給能量】→貯罐【緩沖排氣壓力，穩(wěn)定氣壓】→油水分離器【去除壓縮空氣中的大顆粒油水霧】→空氣冷卻器【冷卻壓縮空氣，使其析出水汽】→水分離器【分離壓縮空氣的水汽】→加熱器【除水后相對(duì)濕度一般為100%，加熱以降至50-60%】→總過濾器【除菌，給全廠提供無菌空氣】→分過濾器【進(jìn)一步除菌，保證各發(fā)酵罐空氣無菌】3-6某生物制藥廠采用空氣冷卻流程一制備無菌空氣，當(dāng)?shù)乜諝庀鄬?duì)濕度60%?？諝膺M(jìn)入總過濾器時(shí)的狀態(tài)是：相對(duì)濕度60%、壓力0.4MPa，溫度35°C。通過計(jì)算確定，當(dāng)?shù)貧鉁刈罡卟荒芨哂诙嗌?？?0、12、15、20、35°C的飽和水蒸汽壓力分別為1228、1418、1705、2339、5615Pa）P1=0.1MPa，P2=0.4MPa，?1=?2，4Pb1=Pb2，根據(jù)飽和蒸氣壓數(shù)據(jù)，得t<12°C3-7深層過濾除菌的機(jī)理是什么？請(qǐng)簡述其各自的作用機(jī)制。深層過濾介質(zhì)的孔隙大于微生物。利用顆粒的慣性沖擊、布朗運(yùn)動(dòng)、顆粒與介質(zhì)的靜電引力、重力沉降等作用將細(xì)菌攔截在介質(zhì)中進(jìn)行除菌。一般認(rèn)為慣性、攔截和布朗運(yùn)動(dòng)的作用較大，而重力和靜電引力的作用較小。慣性沖擊作用：當(dāng)灰塵顆粒隨氣流前進(jìn)遇到過濾介質(zhì)時(shí)，氣流受阻而改變方向，而顆粒因慣性作用仍沿直線向前運(yùn)動(dòng)，與纖維碰撞摩擦而吸附在纖維表面，以此攔截顆粒。攔截滯留作用：在空氣流速較小時(shí)，微粒的流動(dòng)與空氣流線相似，受纖維所阻時(shí)，改變方向，繞過纖維前進(jìn)，并在纖維的周邊形成一層邊界滯流區(qū)。而滯流區(qū)的空氣流速更慢，進(jìn)到滯流區(qū)的微粒慢慢靠近和接觸纖維，從而被粘附滯留。布朗運(yùn)動(dòng)：在很小氣速和較小的纖維間隙時(shí)，則布朗擴(kuò)散作用大大增加了微粒與纖維的接觸機(jī)會(huì)，從而將微粒截留住。重力沉降作用：重力沉降作用是一個(gè)穩(wěn)定的分離作用。當(dāng)微粒所受的重力大于氣流對(duì)它的拖帶力時(shí)，微粒就很容易沉降。大顆粒比小顆粒更易沉降；對(duì)小顆粒來說，只有氣速很慢時(shí)才起作用。一般它與攔截作用相配合，即在纖維的邊界滯流區(qū)內(nèi)，微粒的沉降作用提高了攔截滯留的捕集效率。靜電作用：干空氣與非導(dǎo)體的物質(zhì)（如過濾介質(zhì)纖維）間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)摩擦，會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)電荷。懸浮在空氣中的微生物微粒大多帶有不同的電荷，如枯草桿菌孢子20%帶正電荷，15%帶負(fù)電荷。這些帶電的微粒就會(huì)受異性電荷的物體吸引而沉降。3-8空氣過濾除菌的設(shè)備主要有哪些？各自的作用是什么？粗過濾器【去除大顆粒塵埃，粗過濾器分為布袋過濾器、油浴洗滌和水霧除塵器3種】→空氣壓縮機(jī)【供給能量】→貯罐【緩沖排氣壓力，穩(wěn)定氣壓】→油水分離器【去除壓縮空氣中的大顆粒油水霧】→空氣冷卻器【冷卻壓縮空氣，使其析出水汽】→水分離器【分離壓縮空氣的水汽】→加熱器【除水后相對(duì)濕度一般為100%，加熱以降至50-60%】→總過濾器【除菌，給全廠提供無菌空氣】→分過濾器【進(jìn)一步除菌，保證各發(fā)酵罐空氣無菌】4發(fā)酵技術(shù)4-1發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)有哪些？各種技術(shù)的特點(diǎn)是什么？分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵分批發(fā)酵：發(fā)酵液體積恒定，發(fā)酵液中物質(zhì)濃度隨時(shí)間而變化；分批補(bǔ)料發(fā)酵：在分批發(fā)酵過程中，間隙或連續(xù)的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)技術(shù)。由于只有料液的輸入，沒有輸出，因此，發(fā)酵液的體積在不斷增加；半連續(xù)發(fā)酵：補(bǔ)料分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上加上間歇放掉部分發(fā)酵液（行業(yè)中稱為帶放）；連續(xù)發(fā)酵：補(bǔ)料的同時(shí)放走發(fā)酵液，發(fā)酵液體積不變。4-2?請(qǐng)簡述分批培養(yǎng)過程微生物細(xì)胞的典型生長曲線及其每個(gè)階段的特點(diǎn)。停滯期：剛接種后的一段時(shí)間內(nèi)，因菌種對(duì)新的生長環(huán)境有一適應(yīng)過程，細(xì)胞數(shù)目和菌量不變的過程加速期：通常很短，比生長速率可在短時(shí)間內(nèi)從最小升到最大值。對(duì)數(shù)期：細(xì)胞已完全適應(yīng)其周圍環(huán)境后，便進(jìn)入恒定的對(duì)數(shù)或指數(shù)生長期。減速期：隨著養(yǎng)分的減少，有害代謝物的積累，生長不可能再無限制地繼續(xù)。這時(shí)雖然細(xì)胞量仍舊在增加，但其比生長速率不斷下降，細(xì)胞在代謝與形態(tài)方面逐漸蛻化。平衡期：實(shí)際上是一種生長和死亡的動(dòng)態(tài)平衡，μ【比生長速率】=α【比死亡速率】，凈生長速率等于零。由于此時(shí)菌體的次級(jí)代謝十分活躍，許多次級(jí)代謝產(chǎn)物在此時(shí)大量合成，菌的形態(tài)也發(fā)生較大的變化（如菌體分化，染色變淺，形成空胞等）。死亡期：當(dāng)養(yǎng)分耗竭，對(duì)生長有害代謝物在發(fā)酵液中大量積累便進(jìn)入死亡期。這時(shí)α＞μ，生長呈負(fù)增長。工業(yè)發(fā)酵一般不會(huì)等到菌體開始自溶時(shí)才結(jié)束培養(yǎng)。發(fā)酵周期的長短不僅取決于前面五期的長短還取決于X0（初始濃度）。4-3簡述微生物產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長之間的關(guān)系及其工藝控制策略。生長耦聯(lián)型：微生物的生長、碳水化合物的降解代謝和產(chǎn)物的形成幾乎是平行進(jìn)行的，營養(yǎng)期和分化期彼此不分開，也即代謝產(chǎn)物的生成和細(xì)胞的生長是同步的和完全耦聯(lián)的【策略：延長發(fā)酵周期有利于產(chǎn)物合成】；非生長耦聯(lián)型：產(chǎn)物一般不是直接或間接來自微生物的產(chǎn)能降解代謝，而是通過兩用代謝途徑合成的，所以產(chǎn)物的生產(chǎn)與細(xì)胞生長無直接關(guān)系【策略：如次生代謝產(chǎn)物，則以縮短菌體的對(duì)數(shù)生長期，并迅速獲得足夠量的菌體細(xì)胞后延長生產(chǎn)期，以提高產(chǎn)量】；混合生長耦聯(lián)型：產(chǎn)物間接的與微生物的初級(jí)產(chǎn)能代謝途徑相關(guān)，這類反應(yīng)產(chǎn)物的生產(chǎn)與細(xì)胞的生長僅有間接關(guān)系【策略：根據(jù)其耦聯(lián)程度而靈活調(diào)節(jié)】。4-4名詞解釋：比生長速率：指單位菌體（每克菌體）單位時(shí)間內(nèi)（一小時(shí)）增加的菌體量基質(zhì)比消耗速率：指每克菌體在一小時(shí)內(nèi)消耗營養(yǎng)物質(zhì)的量，它表示細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)利用的速率或效率。產(chǎn)物比生成速率：指每克菌體在一個(gè)小時(shí)內(nèi)合成產(chǎn)物的量，它表示細(xì)胞合成產(chǎn)物的速度或能力。對(duì)基質(zhì)的細(xì)胞得率系數(shù)【YG】：指每消耗1g（或mol）基質(zhì)所產(chǎn)生的菌體重。對(duì)基質(zhì)的產(chǎn)物得率系數(shù)【YP】：指每消耗1g（或mol）基質(zhì)所合成的產(chǎn)物質(zhì)量。基質(zhì)消耗速率方程：。X是當(dāng)前菌濃度，m是細(xì)菌維持生命活動(dòng)的消耗系數(shù)Luedeking-Piret方程：基本形式為，是描述產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)中混合生長耦聯(lián)型的模型。5發(fā)酵工藝5-1培養(yǎng)基的種類有哪些？前體、促進(jìn)劑和抑制劑有何不同？何謂碳分解代謝物阻遏、快速利用氮源、生理酸性和堿性氮源？培養(yǎng)基按純度分為合成培養(yǎng)基【成分完全已知】和復(fù)合培養(yǎng)基【一些成分不完全明確】；按狀態(tài)分固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基；按用途分孢子培養(yǎng)基【繁殖孢子用】、種子培養(yǎng)基【培育種子（用于生產(chǎn)的初始菌）用】、發(fā)酵培養(yǎng)基【生產(chǎn)用】。前體是指加入后能直接在生物合成中結(jié)合到產(chǎn)物分子中而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但產(chǎn)物的產(chǎn)量卻有較大提高的物質(zhì)【如VB12的氯化鈷】。促進(jìn)劑是指既不是營養(yǎng)物又不是前體但能提高產(chǎn)量的物質(zhì)【如促進(jìn)分散的表面活性劑】。抑制劑是指在發(fā)酵過程中加入某些物質(zhì)會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時(shí)會(huì)使另一代謝途徑活躍，從而使所需產(chǎn)物或正常代謝的中間產(chǎn)物得以積累【甘油發(fā)酵中添加亞硫酸氫鈉】。碳分解代謝物阻遏是指微生物在混合碳源發(fā)酵時(shí)優(yōu)先利用速效碳源（通常為葡萄糖），且該碳源的代謝產(chǎn)物會(huì)抑制其它非速效碳源代謝相關(guān)的基因表達(dá)和蛋白活性，從而影響非速效碳源利用的現(xiàn)象?？焖倮玫醇礋o機(jī)氮源，包括氨水、硝酸鹽、銨鹽。無機(jī)氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機(jī)氮源叫生理酸性氮源，代謝后產(chǎn)生堿性物質(zhì)的無機(jī)氮源（NO3-）稱為生理堿性氮源5-2最適pH與微生物生長和產(chǎn)物形成的相互關(guān)系有哪幾種？如何確定某一微生物發(fā)酵的生長和產(chǎn)物形成的最佳pH？又如何控制其pH？最適pH與微生物生長和產(chǎn)物形成的相互關(guān)系有：μ、QP都有一個(gè)相同的較寬的最適pH范圍；μ(或QP)的最適pH范圍一個(gè)很窄、一個(gè)很寬；μ和QP對(duì)pH都很敏感，但最適pH又相同；μ和QP對(duì)pH都很敏感，但最適pH卻不相同?！睛蹋壕w生長；QP：產(chǎn)物合成】菌體生長和產(chǎn)物合成的最適pH根據(jù)實(shí)驗(yàn)來確定。發(fā)酵過程pH的控制方法：1）流加酸：HCl；2）補(bǔ)加氨水或尿素：3）碳酸鈣：中和產(chǎn)生CO24）補(bǔ)料控制pH5-3何謂呼吸強(qiáng)度、耗氧速率、臨界溶氧濃度？呼吸強(qiáng)度：表示微生物的相對(duì)需氧量，指單位重量干菌體在單位時(shí)間內(nèi)消耗的氧量；耗氧速率：是指單位體積培養(yǎng)液在單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞攝?。ɑ蛳模┭醯牧?，也稱攝氧速率；臨界溶氧濃度：各種細(xì)胞對(duì)溶解氧濃度有一個(gè)最低要求，即發(fā)酵過程不需要使溶氧濃度達(dá)到或接近飽和值，只是超過此一氧濃度即可。此時(shí)溶氧濃度就稱為“臨界溶氧濃度”。5-4 氧傳遞速率方程是什么？氧傳遞阻力主要是什么？影響氧傳遞的因素有哪些？請(qǐng)簡述攪拌與通風(fēng)影響溶氧的的機(jī)制。請(qǐng)舉出幾種氧載體。主要傳遞阻力是氣液相間氧傳遞過程；影響氧傳遞的因素有溶氧系數(shù)(KLa)和傳遞推動(dòng)力(C*-CL)；攪拌能夠顯著提高溶氧系數(shù)，具體表現(xiàn)為：1)?攪拌能把大的空氣氣泡打成微小氣泡，a和氣液的接觸時(shí)間增大；2)?攪拌使液體作渦流運(yùn)動(dòng)，延長了氣泡的運(yùn)動(dòng)路線，即增加了氣液的接觸時(shí)間；3)?攪拌使發(fā)酵液呈湍流運(yùn)動(dòng)，從而減少氣泡周圍液膜的厚度，減少液膜阻力；4)?攪拌使菌體分散，避免結(jié)團(tuán)，有利于固液傳遞中的接觸面積的增加，使推動(dòng)力均一。氧載體包括：液態(tài)烷烴、正十二烷、正十六烷、全氟化碳、油酸、硅油、豆油。5-5發(fā)酵過程中泡沫是如何形成的？如何控制泡沫？常用的消泡劑有哪些？請(qǐng)具體寫出幾個(gè)代表性消泡劑。在微生物深層培養(yǎng)過程中由于通氣和攪拌、代謝氣體的逸出以及培養(yǎng)基中糖、蛋白質(zhì)、代謝物等穩(wěn)定泡沫的表面活性物質(zhì)的存在，使發(fā)酵液中產(chǎn)生一定數(shù)量的泡沫?？刂婆菽袃煞N方法：機(jī)械消泡：在攪拌軸上方安裝消沫漿，泡沫借旋風(fēng)離心場而消泡?；瘜W(xué)消泡：利用消泡劑以降低液膜的機(jī)械強(qiáng)度或降低液膜的表面粘度進(jìn)行消泡。6生物反應(yīng)器6-1何謂生物反應(yīng)器？一個(gè)良好的生物反應(yīng)器應(yīng)具備什么條件？生物反應(yīng)器指提供適宜細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成的各種條件，促進(jìn)細(xì)胞的新陳代謝，在低消耗下獲得高產(chǎn)量的一種反應(yīng)設(shè)備。一個(gè)優(yōu)良的生物反應(yīng)器應(yīng)具備的條件：1)?結(jié)構(gòu)簡單；2)?不易染菌；3)?良好的液體混合性能；4)?較高的傳質(zhì)傳熱速率；5)?單位時(shí)間單位體積的生產(chǎn)能力高；6)?同時(shí)還應(yīng)具有配套而又可靠的檢測和控制儀表。6-2常見的通風(fēng)發(fā)酵罐有哪些？分別描述它們各自的結(jié)構(gòu)特征及優(yōu)缺點(diǎn)。1.通用式發(fā)酵罐【既有機(jī)械攪拌裝置，又有壓縮空氣分布裝置】{技術(shù)成熟，通用性好，性能穩(wěn)定；結(jié)構(gòu)復(fù)雜，能耗大，造價(jià)高}2.機(jī)械攪拌式自吸式發(fā)酵罐【利用機(jī)械攪拌的高速旋轉(zhuǎn)而吸入空氣】{省去了壓縮機(jī)；吸程短，易染菌，剪切損傷大}3.氣升式發(fā)酵罐【是指利用空氣的提升作用而使發(fā)酵液循環(huán)，沒有機(jī)械攪拌】{結(jié)構(gòu)簡單，造價(jià)低，避免染菌，能耗低，供氧好，無攪拌剪切；不適宜高粘度或固含量大的發(fā)酵}4.噴射自吸式發(fā)酵罐【利用噴射吸氣裝置吸入空氣而進(jìn)行氣液混合】{三相混合與分散良好，溶氧速率高，能耗低，無需提供壓縮空氣；較易染菌}6-3通用式發(fā)酵罐與氣升式發(fā)酵罐有何區(qū)別？兩者的主要區(qū)別在于：1)?氣升罐功率消耗比通用式罐低；2)?總功率相同時(shí)，氣升罐的氧傳遞速率比通用式罐高；3)?氣升罐比通用式罐結(jié)構(gòu)簡單，且沒有機(jī)械軸封；4)?氣升罐對(duì)細(xì)胞的剪切作用比通用式罐要小得多。6-4厭氧菌培養(yǎng)的特點(diǎn)是什么？酒精發(fā)酵罐為什么沒有機(jī)械攪拌裝置？厭氧菌的氧化與有機(jī)物的還原耦合，因而形成較少的ATP，其細(xì)胞得率比需氧菌少許多。酒精發(fā)酵罐屬于厭氧發(fā)酵罐，發(fā)酵過程不需要供氧，且產(chǎn)生的CO2氣體可以起到類似氣升式罐一般的混合效果，因此沒有機(jī)械攪拌裝置。6-5什么是固體發(fā)酵？其有何優(yōu)缺點(diǎn)？請(qǐng)簡述影響固體發(fā)酵的因素。幾種固體發(fā)酵罐有何共同特點(diǎn)？所謂固體發(fā)酵是指，在濕含量低于90%或不含或很少自由水的固體或含固體顆粒培養(yǎng)基中的發(fā)酵。優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)率高；抗污染強(qiáng)；裝料系數(shù)大；部分微生物生長更好；可以以加工業(yè)殘?jiān)鼮樵?，降低生產(chǎn)成本；提取產(chǎn)物所需的溶劑少；發(fā)酵廢物的處理簡單，可直接干燥作為動(dòng)物飼料。缺點(diǎn)：物料攪拌難，混合不均，控制不易；傳熱性質(zhì)差，溫度控制難；發(fā)酵參數(shù)難以檢測；不太適合細(xì)菌生長；研究不透徹，目前往往依靠經(jīng)驗(yàn)。影響固體發(fā)酵的因素主要有合適菌株的篩選、最適基質(zhì)的確定和控制參數(shù)的優(yōu)化。共同特點(diǎn)是都嚴(yán)格控制了固體發(fā)酵中氧的傳遞、溫度和基質(zhì)的濕含量。7基因工程菌的培養(yǎng)7-1影響工程菌不穩(wěn)定的因素有哪些？培養(yǎng)基的組成：質(zhì)粒在豐富培養(yǎng)基比在低限培養(yǎng)基中更加不穩(wěn)定。合成培養(yǎng)基往往有利于宿主細(xì)胞的生長，但不利于外源基因的表達(dá)；培養(yǎng)溫度：通常低溫有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳；菌體的比生長速率：如果宿主菌的比生長速率比工程菌的大，質(zhì)粒將嚴(yán)重丟失；控制基因的過量表達(dá)：外源基因表達(dá)水平越高，重組質(zhì)粒就越不穩(wěn)定。7-2何謂高密度培養(yǎng)？重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵和核心是什么？其培養(yǎng)技術(shù)有哪幾種？高密度培養(yǎng)是指提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率（單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量）的一種培養(yǎng)技術(shù)，通常指分批補(bǔ)料發(fā)酵技術(shù)。關(guān)鍵是補(bǔ)料策略，即根據(jù)工程菌的生長特點(diǎn)及產(chǎn)物的表達(dá)方式采取合理的營養(yǎng)流加方案，合理流加碳源降低‘葡萄糖效應(yīng)’常見的流加技術(shù)：恒速流加、變速流加、指數(shù)流加、反饋流加。7-3請(qǐng)簡述畢赤酵母作為外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)的原理。何謂“三段法”？重組畢赤酵母高密度培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意哪些問題？畢赤酵母為甲醇利用型酵母，能以甲醇為唯一碳源和能源生長。甲醇利用途徑的第一個(gè)酶為醇氧化酶（AOX）。生長在限量甲醇中的細(xì)胞能誘導(dǎo)出大量該酶，而生長在甘油、葡萄糖或乙醇中的細(xì)胞卻不能產(chǎn)生該酶。因此，可利用醇氧化酶基因（AOX1）作為強(qiáng)啟動(dòng)子來構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)而高效表達(dá)外源蛋白