二代測(cè)序技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌中的臨床應(yīng)用課件

NGS技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用1精選課件目錄123DNA測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療概述NGS檢測(cè)技術(shù)貫穿非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療全程2精選課件DNA測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介PART013精選課件DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程一代測(cè)序技術(shù)二代測(cè)序技術(shù)(NGS)三代測(cè)序技術(shù)化學(xué)降解法雙脫氧鏈終止法（Sanger法）熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)雜交測(cè)序技術(shù)Roche公司的454測(cè)序技術(shù)Illumina公司的Solexa技術(shù)ABI公司的SOLiD技術(shù)Life公司的IonTorrent技術(shù)Helicos公司的Heliscope單分子測(cè)序儀PacificBiosciences公司的SMRT技術(shù)OxfordNanoporeTechnologies納米孔單分子測(cè)序技術(shù)孫海汐,王秀杰.DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展及其展望[J].科研信息化技術(shù)與應(yīng)用,2009(03):18-29.20世紀(jì)中葉至20世紀(jì)末2005年至今2008年至今4精選課件各大DNA測(cè)序技術(shù)的比較技術(shù)代表技術(shù)通量時(shí)間優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)第一代DNA測(cè)序Sanger（雙脫氧鏈終止法）為代表低1977年1）準(zhǔn)確率高

2）讀長(zhǎng)較NGS長(zhǎng)1）通量低、成本高2）對(duì)樣本中腫瘤細(xì)胞的含量和比例要求較高3）靈敏度低第二代DNA測(cè)序（NGS）邊合成邊測(cè)序高2005年1）大規(guī)模平行測(cè)序

2）定量

3）比Sanger技術(shù)成本低廉

4）靈敏度高，適用于起始濃度很低的樣本（液態(tài)活檢）1）錯(cuò)誤率較Sanger測(cè)序高

2）樣本建庫流程繁瑣

3）多次PCR存在系統(tǒng)誤差，無法通過后續(xù)加深測(cè)序糾正

4）數(shù)據(jù)量大，對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)的拼接、生物信息學(xué)分析要求極高第三代DNA測(cè)序單分子測(cè)序中-高2008年1）讀長(zhǎng)長(zhǎng)

2）單分子測(cè)序，無需建庫、模板擴(kuò)增，保留樣本最原始的信息。

3）測(cè)序同時(shí)可檢測(cè)堿基修飾的情況，如甲基化、乙?；?/p>

4）可以做全轉(zhuǎn)錄本的測(cè)序，分析可變剪切1）由于建庫無需PCR，因此對(duì)于上機(jī)樣本的濃度要求較高2）測(cè)序成本較NGS高

3）目前臨床應(yīng)用的實(shí)例較少

4）無法表達(dá)定量5精選課件DNA二代測(cè)序技術(shù)（Nextgenerationsquencing，NGS）的應(yīng)用ABDEC2009年，NGS用于罕見遺傳病分子病因?qū)W研究和診斷遺傳病2008年首次報(bào)道NGS應(yīng)用于急性髓細(xì)胞性白血病，此后NGS被廣泛應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域；2014年，NGS技術(shù)應(yīng)用于血漿ctDNA檢測(cè)；2017年11月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)首個(gè)腫瘤多癌腫多基因檢測(cè)平臺(tái)MSK-IMPACT；2017年12月，F(xiàn)DA式批準(zhǔn)了首個(gè)NGS體外診斷（IVD）上市腫瘤2013年，NGS應(yīng)用于人類胚胎細(xì)胞非整倍體篩查的臨床前研究胚胎植入前遺傳學(xué)診斷與篩查2008年，華大基因嘗試用NGS檢測(cè)胎兒游離DNA2010年，基于NGS的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查開始進(jìn)入臨床無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(cè)……DNA二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用6精選課件非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療概述PART027精選課件在中國，肺癌的發(fā)病率及死亡率均居第一位陳萬青，等.2013年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤2017，26（1）：1-78精選課件肺癌從單病種—組織分型—分子分型的演變肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)兩大類，NSCLC約占85%，主要分為肺腺癌、肺鱗癌和大細(xì)胞癌等。肺腺癌約占NSCLC40%-50%，肺鱗癌約20%-30%，大細(xì)胞癌約1.5%NSCLC不再是一個(gè)疾病，而是一組疾病，需要分類治療，分子分型是關(guān)鍵XuYetal.,TherClinRiskManag.2016May24;12:807-16Shamesetal.,JPathol.2014Jan;232(2):121–33LiT,etal.JClinOncol.2013Mar10;31(8):1039-49.9精選課件HerbstRSetal.,Nature.2018Jan24;553(7689):446-454歐美人群與中國人群NSCLC的分子特征有所不同HerbstRS等2018年1月發(fā)表于《Nature》的綜述中指出歐美人群中：肺腺癌中常見激活突變位于PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF兩大信號(hào)通路，包括癌基因EGFR、KRAS、ERBB2/3、MET、ALK、RET、ROS、BRAF等。失活突變包括抑癌基因TP53、KEAP1和NF1等肺鱗癌中常見激活突變包括癌基因FGFR1-3、PIK3CA、KRAS、AKT、BRAF等，較少見EGFR擴(kuò)增。失活突變包括抑癌基因TP53、CDKN2A10精選課件歐美人群與中國人群NSCLC的分子特征有所不同Oncotarget.2016Jul5;7(27):41691-41702.A.1770例中國NSCLC患者測(cè)序結(jié)果顯示常見激活突變包括癌基因EGFR、KRAS、ALK、ERBB2(HER2)、MET、RET、BRAF、ROS1等。其中EGFR突變比例為50.3%，占據(jù)NSCLC突變半壁江山，遠(yuǎn)高于歐美人群27%B.904例非吸煙肺腺癌患者測(cè)序結(jié)果顯示常見激活突變包括癌基因EGFR、ALK、KRAS、ERBB2(HER2)、MET、RET、BRAF、ROS1等。其中EGFR突變比例高達(dá)74.5%，表明EGFR基因在中國肺腺癌患者中至關(guān)重要11精選課件肺癌進(jìn)入精準(zhǔn)治療時(shí)代：根據(jù)分子分型決定治療方案DeborahBetal.,JAMAOncol2018Apr01;4(4).12精選課件NGS二代測(cè)序ddPCR數(shù)字PCRARMS-PCRFISH熒光原位雜交IHC免疫組化01.02.03.04.05.臨床常用的分子檢測(cè)診斷技術(shù)用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(ARMS)，利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物；只有在引物3’堿基與模板配對(duì)時(shí)才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，野生型的不擴(kuò)增通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結(jié)果的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結(jié)果的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)在Sanger測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè)DNA的序列信息13精選課件檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)可檢測(cè)的變異形式AMRS-PCR1、靈敏度3%-10%2、擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，封閉的體系，減少污染的可能性1、只能檢測(cè)已知突變2、如果檢測(cè)突變點(diǎn)或者類型較多，出現(xiàn)特異產(chǎn)物概率也增加3、當(dāng)檢測(cè)位點(diǎn)較多時(shí)，對(duì)DNA樣本需求增加4、無法測(cè)融合、大片段插入/缺失點(diǎn)突變、小片段插入/缺失熒光原位雜交FISH1、靈敏度高、特異度高2、空間定位準(zhǔn)確，可同時(shí)分析分裂期和間期多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量1、通量低、成本高2、對(duì)操作和判讀技術(shù)要求高，不同讀片者判讀差異較大拷貝數(shù)變化、大片段插入/缺失、融合/重排。擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)免疫組化IHC1、可對(duì)組織和細(xì)胞中相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位及定量研究2、經(jīng)濟(jì)快捷1、抗體的選擇2、檢測(cè)者組織的固定3、觀察者解釋方面的差異僅檢測(cè)蛋白表達(dá)水平ddPCR1、單位點(diǎn)精準(zhǔn)度非常高2、可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)1、多位點(diǎn)血檢匹配度不高，2、已知位點(diǎn)測(cè)序點(diǎn)突變、小片段插入/缺失二代測(cè)序NGS1、大規(guī)模、高通量2、能檢測(cè)各種變異形式3、靈敏度1%-3%1、成本較高2、引入PCR過程會(huì)在一定程度上增加測(cè)序的錯(cuò)誤率，并且具有系統(tǒng)的偏向性，同時(shí)讀長(zhǎng)也比較短3、對(duì)數(shù)據(jù)注釋和報(bào)告解讀要求高點(diǎn)突變擴(kuò)增融合/重排插入/缺失臨床常用的分子檢測(cè)診斷技術(shù)優(yōu)劣勢(shì)比較14精選課件CAP、IASLC及AMP三大權(quán)威機(jī)構(gòu)推薦由單基因檢測(cè)發(fā)展為多基因檢測(cè)JMolDiagn.2013Jul;15(4):415-53.JMolDiagn.2018Mar;20(2):129-159.2013201815精選課件近年NCCN指南均建議進(jìn)行廣泛基因檢測(cè)16精選課件檢測(cè)方法樣本來源變異類型點(diǎn)突變新位點(diǎn)融合擴(kuò)增突變負(fù)荷MSIEGFR/BRAFMET-14exonskipALK/ROS1/RETMET/HER2TMB---IHC組織有限（BRAF）否是是否是血液否否否否否否FISH組織否否是是否否血液否否否否否否PCR（ARMS/ddPCR）組織是否是（已知類型）是否否血液是否是（已知類型）是否否NGS組織是是是（已知+未知）是是是血液是是是（已知+未知）是是是傳統(tǒng)分子檢測(cè)方法存在局限性，NGS平臺(tái)能夠全面滿足NSCLC現(xiàn)有分子檢測(cè)診斷需求17精選課件NGS檢測(cè)技術(shù)貫穿非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療全程PART0318精選課件NGS檢測(cè)貫穿非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療全程19精選課件NGS+ctDNA有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)JillianPhallenetal.,SciTranslMed.2017Aug16;9(403)Jillian運(yùn)用基于NGS平臺(tái)的目標(biāo)錯(cuò)誤校正測(cè)序(TEC-Seq)方法，對(duì)ctDNA的序列變化進(jìn)行超靈敏的直接評(píng)估發(fā)現(xiàn)：健康人群中未檢出腫瘤特異性基因突變；以健康人作為對(duì)照，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌患者都檢測(cè)到了腫瘤特異性突變；早期腫瘤就能夠檢出腫瘤特異性基因突變；檢測(cè)腫瘤特異性基因突變與癌癥的臨床分期呈正比Jillian認(rèn)為基于NGS平臺(tái)的TEC-Seq分析方法為早期腫瘤的無創(chuàng)檢測(cè)提供了廣泛適用的方法，可能對(duì)癌癥患者的篩查和管理有用，提示ctDNA用于常見癌種早期診斷的可能性。20精選課件CSCO指南認(rèn)可NGS在非小細(xì)胞肺癌分子分型的作用中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)指南工作委員會(huì)，中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)原發(fā)性肺癌診療指南2018版21精選課件NGS有助于分析非小細(xì)胞肺癌分子分型演講，指導(dǎo)后續(xù)治療英國TRACERx肺癌研究計(jì)劃的首個(gè)成果2017年發(fā)表于《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》，其中提到：NSCLC腺癌“進(jìn)化”的早期：諸如EGFR、MET、BRAF和TP53之類基因的突變/擴(kuò)增往往發(fā)生在克隆水平；這些基因往往與NSCLC的形成有關(guān)，屬于驅(qū)動(dòng)基因NSCLC“進(jìn)化”的晚期：75%的腫瘤出現(xiàn)了亞克隆水平的各種變異，而且這些變異還位于腫瘤的不同區(qū)域；是造成腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性的原因M.Jamal-Hanjanietal.,NEnglJMed.2017Jun1;376(22):2109-2121早期晚期22精選課件NGS指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化用藥及療效預(yù)測(cè)Tsaoetal.,JThoracOncology.Vol.11No.5:613-638DeborahBetal.,JAMAOncol2018Apr01;4(4).晚期非小細(xì)胞肺癌藥物治療靶向、免疫、化療三分天下，此時(shí)基于NGS平臺(tái)的多基因檢測(cè)優(yōu)勢(shì)明顯23精選課件NGS指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化用藥及療效預(yù)測(cè)RizviNA,HellmannMD,etal.Science,2015,348(6230):124-128Rizvi對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)進(jìn)行全外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)腫瘤中更高的非同義突變負(fù)荷(H-TMB)人群有更好的無進(jìn)展生存期(PFD)，并且對(duì)PD-1單抗(pembrolizumab)有持久的反應(yīng)(DCB)24精選課件NGS能夠幫助發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌耐藥機(jī)制及判斷預(yù)后KeEE等納入224名EGFR突變并獲得EGFR-TKI耐藥的晚期NSCLC患者，分析T790M突變、MET擴(kuò)增、組織學(xué)轉(zhuǎn)化、KRAS、PIK3CA突變、ALK融合等耐藥機(jī)制，其發(fā)現(xiàn)：19-del缺失組的T790M突變（50.4%）顯著比L858R突變組（36.5%）高；T790M突變的患者中觀察到明顯的OS益處，中位OS36.0個(gè)月；在調(diào)整T790M基因型的多變量分析中，EGFR突變亞型不再被認(rèn)為是顯著的；結(jié)果報(bào)道：EGFRT790M高比例突變對(duì)于Exon19缺失比L858R突變的患者有更好的存活率，預(yù)后更好。Ke

EE,et

al.,JThoracOncol.2017Sep;12(9):1368-1375.25精選課件NGS+ctDNA早期提示腫瘤復(fù)發(fā)ChaudhuriAA，etal.,CancerDiscov.2017Dec;7(12):1394-1403.ChaudhuriAA等采用深度測(cè)序(CAPP-seq)循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)分析方法，對(duì)40例I-III期肺癌患者和54名健康成人的255份樣本進(jìn)行了癌癥個(gè)性化監(jiān)測(cè)，其發(fā)現(xiàn)：94%的患者在治療后的血液樣本中檢測(cè)到ctDNA定期接受ctDNA監(jiān)測(cè)的患者，在接受根治性治療后，第一次檢測(cè)到ctDNA的時(shí)間，比CT明確提示腫瘤復(fù)發(fā)，平均提前了5.2個(gè)月ctDNA中相應(yīng)基因檢測(cè)，還可以用來區(qū)別到底是疾病復(fù)發(fā)還是正常術(shù)后改變26精選課件NGS正在