贛葛1號組織培養(yǎng)微型扦插繁殖技術(shù)規(guī)程

1贛葛1號組織培養(yǎng)苗扦插繁殖技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了贛葛1號組織培養(yǎng)微型扦插繁殖技術(shù)的范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、組培準備、培養(yǎng)基制作、材料選取、莖節(jié)微扦插、繼代增殖、生根和試管苗移栽等。本文件適用于葛苗工廠化快繁生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，凡注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6001育苗技術(shù)規(guī)程NY/T1000容器育苗技術(shù)DB23/T2514藍靛果組培微插育苗技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1組織培養(yǎng)PlantTissueCulture指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在無菌條件下接種在含有各種營養(yǎng)物質(zhì)及植物激素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。3.2微型扦插Micro-cutting使用外源激素，促進具有頂芽或沒有頂芽的休眠側(cè)芽啟動生長，進行芽苗的增殖培養(yǎng)，迅速獲得大量的芽苗后再進行生根培養(yǎng)，得到完整植株的這種繁殖方式稱為“微型扦插”，即使用腋芽的外植體，萌芽更快，能一次成苗、遺傳更穩(wěn)定、成活率更高的短枝發(fā)生型培養(yǎng)技4組培準備4.1儀器設(shè)備2培養(yǎng)基制作及滅菌設(shè)備：天平、純水機、PH儀、高溫高壓蒸汽滅菌鍋、電熱鼓風干燥箱等。無菌操作設(shè)備：超凈工作臺、滅菌器等。培養(yǎng)室設(shè)備：空調(diào)、定時器、培養(yǎng)架、搖床、光照培養(yǎng)箱、人工氣候室等。藥品儲存與配制設(shè)備：冰箱、萬分之一天平等。4.2器皿及器材培養(yǎng)器皿：試管、錐形瓶、培養(yǎng)皿及各類專用培養(yǎng)瓶；盛裝器皿：燒杯、試劑瓶；計量器皿：量筒、容量瓶；操作器材：培養(yǎng)基分注器、細菌過濾器、鑷子、剪刀、解剖刀。4.3化學試劑包括組培苗基本培養(yǎng)基所需的無機鹽類、有機物類及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)類等。MS基本培養(yǎng)基成分及母液配制參見附錄A；其它常用試劑及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的配制參見附錄B。5培養(yǎng)基制作5.1MS基本培養(yǎng)基配置制作培養(yǎng)基前需先配制MS基本培養(yǎng)基母液（配方及配制方法見附錄A），配好后4℃保存（保存期不超過180d）。采用附錄C方法配制好固體MS培養(yǎng)基，組培瓶分裝后放入高溫高壓蒸汽滅菌鍋，在0.1Mpa，121℃條件下滅菌20min，取出冷卻凝固后備用。5.2培養(yǎng)基配方莖節(jié)微扦插不定芽誘導培養(yǎng)基：MS+1.5mg/L6-BA+1mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂粉，pH5.8，固體培養(yǎng)基；不定芽增殖培養(yǎng)基：MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂粉，pH5.8，固體培養(yǎng)基；芽苗生根培養(yǎng)基：MS+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂粉，pH5.8，固體培養(yǎng)基；6材料選取選取無病蟲害、長勢健壯的葛藤幼嫩莖節(jié)作為誘導材料。37莖節(jié)微扦插7.1前處理剪取新鮮帶莖節(jié)、長約3cm左右的葛莖段，將其置于流水下沖洗30min后，再置于干凈燒杯中，在超凈工作臺上進一步消毒（75%酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，0.1%氯化汞浸泡20min，無菌水沖洗3次）。將消毒好的莖段置于滅好菌的濾紙上，用鑷子和解剖刀片對莖段進行切割，一手用鑷子固定莖段，一手用解剖刀片進行切割，切除腋芽，將莖段切至1cm左右（帶莖節(jié)）。用鑷子夾起將其插入不定芽誘導培養(yǎng)中，形態(tài)學上端（分生迅速，向上或者向下延伸的稱為上端）朝上擺放固定，接種后做好標記，寫明材料名稱、接種日期。7.2不定芽誘導將接種莖段的培養(yǎng)瓶放置無菌培養(yǎng)室中培養(yǎng)（25℃,54μmol·m-2·s-1，14h/d），待莖段生長30d后，將誘導出的不定芽移至增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。8繼代增殖將增殖的不定芽從其基部切取分離。8.2增殖將切取的不定芽基部組織轉(zhuǎn)接到組培苗增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)30d后，將增殖的芽再繼續(xù)切成單芽在增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。8.3擴繁每繼代1次單芽可增殖4個~6個，每個單芽可繼代擴繁5次，可獲得1000株~7000株種苗。9生根培養(yǎng)選取株高4cm~5cm健壯的組培苗，將莖基部愈傷組織和自發(fā)根系切除，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上誘導生根。9.2培養(yǎng)在室溫為25℃,光照強度為54μmol·m-2·s-1，環(huán)境相對濕度為60%和光周期為晝夜14h/10h條件下培養(yǎng)18d~21d），同時苗長有主、側(cè)根時即可移栽。410試管苗移栽選擇葉色濃綠，生根數(shù)多，高5-6cm健壯的組培苗，打開瓶蓋，在自然光、室溫下煉苗2~3d。10.2馴化移栽10.2.1馴化移栽基質(zhì)制備采用泥炭、蛭石和珍珠巖的混合物，按泥炭：蛭石：珍珠巖=3：2：1的比例混合，然后放置在121℃高溫滅菌鍋中滅菌30min，冷卻后裝入營養(yǎng)缽中，放置在塑料大棚苗床內(nèi)備用，移栽前先用自來水澆透基質(zhì)。10.2.2移栽從培養(yǎng)瓶中取出經(jīng)過鍛煉的組培苗，用自來水洗去附著的培養(yǎng)基，然后移栽到營養(yǎng)缽中。10.2.3秧苗管理待全部苗移栽完畢，在苗床上方覆蓋塑料薄膜小拱棚，每天上午用噴霧器噴霧，保持基質(zhì)和空氣濕潤，相對濕度保持在85％左右。第10d后逐漸揭開塑料膜，繼續(xù)煉苗；20d后就可以將秧苗移栽到種植地，移栽后的3d內(nèi)需進行遮陽，之后進入正常的田間管理。5附錄AMS培養(yǎng)基母液配方及配制母液成分用量定容每升用量母液1（50倍）NH4NO382.5g1000mL20mLKNO395.0gMgSO4·7H2O母液2（100倍）CaCl2·H2O44.0g1000mL母液3（100倍）KH2PO41000mL母液4（100倍）Na2-EDTA3.730g1000mLFeSO4·7H2O2.780g母液5（50倍）H3BO30.31g1000mL20mLMnSO4·4H2OZnSO4·7H2O0.43gKI0.0415gNaMoO4·2H2O0.0125gCuSO4·5H2O0.00125gCoCl2·6H2O0.00125g母液6（200倍）肌醇（Inositol）20.0g1000mL5mL甘氨酸（Gly）0.4g煙酸（VB3）鹽酸吡哆醇（VB6）煙酸硫胺素（VB1）0.020g6植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液配制MS培養(yǎng)基配制1LMS基本培養(yǎng)基配制：根據(jù)培養(yǎng)基成分準備好蒸餾水、瓊脂、蔗糖和各類母液等。加蒸餾水800mL（按所需容量的80%左右），再加入瓊脂6.5g，加熱并不斷攪拌使瓊脂完全融化。加入蔗糖30g，待完全溶解后，按附錄A加入母液，再根據(jù)要求加入適量植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)并充分攪拌，最后定容至1L。用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.8。一加熱溶解一PH值調(diào)整一混合培養(yǎng)瓶一一加熱溶解一PH值調(diào)整一混合培養(yǎng)瓶一洗滌一干燥1.培養(yǎng)基的配置程序水、MS、分裝加蓋封口高壓滅菌 接種-凝固-冷卻加蓋封口高壓滅菌2.MS培養(yǎng)基成分及含量序號試劑名稱含量mg/L序號試劑名稱含量mg/L1硝酸鉀硝酸銨2磷酸二氫鉀硫酸鎂3703氯化鈣440碘化鉀0.834硼酸6.2硫酸錳22.35硫酸鋅8.6鉬酸鈉0.256硫酸銅0.025氯化鈷0.0257乙二胺四乙酸二鈉37.3肌醇8硫酸亞鐵27.8煙酸0.59甘氨酸2鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫胺素0.1注：MS培養(yǎng)基由杭州百思生物