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文檔簡介

實驗十四凝膠層析法測定細胞色素C的分子量一、目的1、了解凝膠過濾法測定蛋白質分子量的原理；2、掌握運用該法測定生物大分子量的步驟；3、懂得層析過程中的操作對分配系數(shù)確定的影響。二、原理

凝膠層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠，對混合物中各組分按分子大小進行分離的層析技術。把含有不同分子量的混合液，加在膠面上，讓它流過凝膠柱。當混合液通過凝膠顆?？p隙中時，溶液中的溶質凡是比篩孔小的分子，都能自由進入顆粒內部，而比網(wǎng)孔大的分子則不能進入，介于二者之間的分子量則部分地進入篩孔。因此，在洗脫過程中，大分子物質在凝膠中的移動速度快，先從層析柱中流出，小分子物質后流出（見圖十五），從而達到分離的目的。測定生物大分子的分子量是凝膠層析法的重要用途之一。用于分子量測定的凝膠有交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠等。4、上樣與洗脫

(1）上樣前先檢查凝膠床面是否平整，如果傾斜不平整，可用玻棒將床面輕輕攪動，讓凝膠自然下降，形成水平狀態(tài)的膠面。用細長吸管小心吸去膠面上大部分溶液，然后讓液面自然下降，直至幾乎露出床面。

(2）用移液管吸取藍色葡聚糖溶液0.15ml,細胞色素C0.4ml置1ml的小離心管中，混勻后，用長吸管將樣品沿柱子壁、非常小心地滴加到凝膠床面上，注意不要將床面凝膠沖起。加完后，再打開底端出口，使樣品流至床表面。用少量洗脫液同樣小心清洗表面1次，然后將洗脫液在柱內約加至5㎝高。

(3）連接儲液瓶、層析柱、部分收集器，讓洗脫液恒壓（30-50㎝水柱）洗脫，用部分收集器按每管3ml/7min收集洗脫液，各管于650nm(藍色色溶液)、410nm（紅色溶液）檢測消光值（A）。五、結果與分析1、以管號（或洗脫液體積）為橫坐標、相應分子量的對數(shù)為縱坐標，繪制洗脫曲線。2、根據(jù)洗脫峰位置量出藍色葡聚糖和細胞色素C的洗脫體積Vo和Ve，測量出凝膠柱的長度h和柱內徑d，按柱體積公式計算Vt.Vt＝πχ(1/2d)2χ

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