（整理）分子實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)總結(jié)-郁娟娟

（整理）分子實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)總結(jié)——郁娟娟DNAstar：序列拼接MEGA：分析堿基組成CLUSTAL：序列比對(duì)PAUP：跑樹DABE：飽和性分析總思路：序列拼接-比對(duì)-四、下載序列的方法打開.Fasta格式的序列-Fileexport-sequancealignment-保存在NCBI上找到相應(yīng)的序列方法：SearchNucleotidefor文章的genibank序列號(hào)-reports-復(fù)制序列到txt文件中，刪除沒用的東西，只留下序列和學(xué)名。保存成txt文件后，打開Editseq-將,txt序列復(fù)制到其中-save保存為seq格式五、將拼接序列翻譯成蛋白質(zhì)方法打開拼接的序列-全選中-Goodies-translateDNA2、如何計(jì)算堿基含量比值、答：MEGA-NucleotideComposition六、DAMBE序列飽和性分析序列的飽和性分析在DAMBE程序中，以轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)為縱軸，以TN93模型（TamuraandNei,1993）校正的距離為橫軸做散點(diǎn)圖。如果這些點(diǎn)隨序列間分歧增大呈線性分布就說明序列間替換沒有達(dá)到飽和，序列可以用于后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析。DAMBE還長(zhǎng)用在單倍型的歸納、基因頻率和堿基組成分析、遺傳距離計(jì)算、序列排序、5.2.2堿基替換飽和效應(yīng)的檢驗(yàn)當(dāng)核苷酸序列分歧較小時(shí)，序列之間被觀察到的核苷酸差異數(shù)接近實(shí)際替換數(shù)。如果序列分歧較大，DNA序列的變異可能會(huì)受到飽和效應(yīng)的影響，這時(shí)觀察到的堿基差異可能包含了部分進(jìn)化雜音。一般說來，堿基轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率高于顛換，但是隨物種分歧程度的增加，轉(zhuǎn)換/顛換的比率接近或小于1，說明轉(zhuǎn)換可能已經(jīng)趨于飽和并可能成為進(jìn)化雜音，所以轉(zhuǎn)換和顛換發(fā)生的頻率與序列間分歧度的關(guān)系就可以反映出堿基替換是否受飽和效應(yīng)的影響。在著手構(gòu)建分子系統(tǒng)樹前，為了排除這種進(jìn)化雜音獲取正確的進(jìn)化信息，必須對(duì)目的片段的堿基替換是否受到飽和效應(yīng)的影響進(jìn)行檢驗(yàn)。用DAMBE（Xia，2000）分別對(duì)四個(gè)mtDNA片段的堿基替換模式進(jìn)行檢測(cè)，以此估計(jì)所研究mtDNA片段的堿基替換是否受到飽和效應(yīng)的影響。打開DAMBE-FILE-Openstandardsequencefile-類型unknown-打開proteincodingnuc.seq-invMtdna-trains-table–go-graphics-trainsitionandtranversionversisadvance–tn93-g0-graphstyle-curveonly-保存.bmp問題1、如何計(jì)算密碼子的不同位上堿基變化，轉(zhuǎn)換顛換比值2、如何進(jìn)行序列的飽和性分析序列的飽和性分析在DAMBE程序中，以轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)為縱軸，以TN93模型（Tamura&Nei,1993）校正的距離為橫軸做散點(diǎn)圖。如果這些點(diǎn)隨序列間分歧增大呈線性分布就說明序列間替換沒有達(dá)到飽和，序列可以用于后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析。3、如何看用Editseq檢驗(yàn)拼接后的序列是否能正確翻譯為蛋白質(zhì)4、如何計(jì)算遺傳距離（DAMBE）一、DNAstar：序列拼接在序列的拼接時(shí)，修改紅色和小寫字母的堿基具體步驟：1、ABI文件包括圖形和序列、SEQ文件只有序列沒有圖。2、DNAstar—seqman—File—NEW，把序列都放近去，有兩個(gè)正向，倆個(gè)反向的序列—Timeends—LOW—SEANALL-ASSEMBLE–出現(xiàn)contig打開-雙擊contig_@_核對(duì)-contig-saveconsenus-singlefile-保存位置-sequce-add-選擇保存到的位置-點(diǎn)序列名字-add-雙擊-拼接完關(guān)閉。3、原始序列和拼接的序列各保存在一個(gè)文件夾內(nèi)。4、EDIT-GOODIES-TRALS翻譯成蛋白質(zhì)?！?、從ncbi上下載相關(guān)的序列和測(cè)得的序列保存在一個(gè)文件夾內(nèi)，把前面的內(nèi)容都刪除，保留種名。加〉符號(hào)-保存二、序列的比對(duì)6、先切齊序列：用Seqman-sequence-add-skip-把所有的序列加進(jìn)去進(jìn)行刪除，使序列整齊。-contig雙擊,將序列切齊，再復(fù)制到一個(gè)新建的文本文檔。7、切齊后保存方式：contig-exportsequences-multiplefiles=setlocation-file-保存切齊8、當(dāng)在切齊的序列中發(fā)現(xiàn)反向序列要改正：用editseq打開序列-selectall–goodies-resersecomplement-全選粘貼到文本文檔中，目的是比對(duì)。三、構(gòu)建NJ樹方法(MEGA)1、將TXT格式保存為nexus和clustal格式（生成aln\dnd\nxs）CLUSTAR-進(jìn)行比對(duì)-FILE-LOADSEQUENCE-打開新建的文本文檔txt-加入進(jìn)去后-aligment-docompleteAlignment-File-Savesequenceas–format-custal-ok-File-Savesequenceas–format-NEXUS最后保存為nexus和clustal格式，NEXUS是PAUP格式-關(guān)閉clustal.2、點(diǎn)擊MEGA-File-opendata-.aln文件-打開-ok-點(diǎn)擊向下的綠色圖標(biāo)-ok-ok-刪除最后沒用的東西-保存-切齊序列,meg-3、點(diǎn)擊MEGA-File-opendata-切齊序列,meg-ok-yes-inverttebrateMitochondrial-ok-4、phylogency-constructphylogency-NJ樹-none改成bootstrap-k2p-compute-保存（image-EMF）5、使用Mega2.0分析序列間的p-distance,即兩兩序列間的核酸差異比例，分析序列變異情況方法1：Distance-computepairwise-distanceonly改為stderr-compute方法2：pattern-computecompositiondistance三、構(gòu)建MP樹方法1、MrBays，目的是轉(zhuǎn)化為.nex文件步驟為：用bioedit將.txt文件比對(duì)轉(zhuǎn)換成.nex文件格式方法：打開BioEdit，將.txt文件打開-Accessoryapplication-clustalmultiplealignment-File-export-sequenceAligment-選paup/nex命令.nex-保存-把.nexbegin前面的都刪除。File-open-切齊序列.txt-accessoryappliacation-clustalmultiplealigment-file-expore-sequencealigment-選paup/nenu命名.nex-保存2、在.nex中加命令模板;end;beginpaup;logfile=coimp;setmaxtrees=1000;setcriterion=parsimony;hsearchaddseq=randomnreps=1000;showtrees;describetrees1/plot=phylogrambrlens=yes;savetreesfile=coi(mp).treroot=yesbrlens=yes;contreeall/file=coi.tre;pscoreall/CI=yesRI=yesRC=yes;bootstrapnreps=1000keepall=yessearch=heuristic/addseq=randomnreps=100;savetreesfile=coi(mpb).treroot=yes;END;2、打開paup-打開1.nex-open–開始跑樹3、用treeview打開.tree樹。MrBays建樹1、用bioedit將.txt文件比對(duì)轉(zhuǎn)換成.nex文件格式方法：打開BioEdit，將.txt文件打開-Accessoryapplication-clustalmultiplealignment-File-export-sequenceAligment-選paup/nex命令.nex-保存-把.nexbegin前面的都刪除。File-open-切齊序列.txt-accessoryappliacation-clustalmultiplealigment-file-expore-sequencealigment-選paup/nenu命名.nex-保存2、用paup運(yùn)行.nex文件3、接著繼續(xù)用paup打開modeltest3.7文件夾中的modelpaupblock命令-運(yùn)行結(jié)束后，在modeltest的modelfolder中生成一文件名為”model.scores”文件。4、運(yùn)行modeltest批處理文件，生成一文件名為”mt.txt”文件，則為最適合的模型文件5、將最適模型文件中的參數(shù)(hLRTs)拷貝到.nex文件后，加入貝葉斯運(yùn)行命令，并改正.ne格式等。刪除前后沒用的，改正外群名字等。只能用一個(gè)外群。beginmrbayes;logstartfilename=coibayes.log;outgroupCinara;Prsetstatefreqpr=dirichlet(0.3321,0.1058,0.1271,0.435);Lsetnst=6rates=gamma;mcmcngen=1000000printfreq=100nchains=4savebrlens=yesstartingtree=random;end;6、將加好命令的.nex文件拷貝到MrBayes文件夾所在路徑內(nèi)，運(yùn)行人頭的MrBayes,輸入execute.文件名.net,回車。7、輸入sumpburnin=1000回車8、輸入sumtburnin=1000回車9、運(yùn)算完畢后點(diǎn)擊close彈出一對(duì)話框，輸入命令語句“savetreefile＝文件名.tre；”回車。菜單欄Tree中的Showinternaledgelabels即可顯示各結(jié)點(diǎn)的bootstrap值。9、生成的.con，用treeview打開注意：貝葉斯樹只能用一個(gè)外群。建設(shè)一個(gè)新文件夾，將.scores、mt.txt、txt、nex文件都放到一個(gè)文件夾內(nèi)。ML建樹方法同MrBays相似。預(yù)測(cè)模型利用貝葉斯得到的模型。把ML命令模板拷貝到.nex，把logfile改成自己的名(=coiML)，外群也改(Daktulosphaira_vitifoliaeCinara_edulisC_arizonica);-把最適模型lsetbase---likhood下面savetreefile=coisavetreesfile=coin(mb)LsetBase=(0.33650.09760.1280)Nst=6Rmat=(26794342.00008028280.500010365153.00001.4084255543472.0000)Rates=equalPinvar=0.7355;–生成的.nex.con文件-treeview打開。注意：外群要寫成Cinara_edulis形式，可以有多個(gè)外群。打開方式和mp樹一致。戴傳銀筆記PAUPNJtreebeginpaup;outgroupoutgroupname;setcriterion=distance;bootstrapsearch=njnreps=1000keepall;savetreesfile=nj.tre;end;PAUPMPTREEbeginpaup;outgroupoutgroupname;setcriterion=parsimony;hsearchaddseq=simple(random)bootstrapnreps=1000;describetrees1/plot=phylogrambrlens=yes;savetreesfrom=1to=1000;end;PAUPMLTREEbeginpaup;outgroupoutgroupname;setcriterion=likelihood;gettreesfile=xxx.tre;(xxxmodeltest文件保存的樹的名稱)hsearchaddseq=asisbootstrapnreps=1000;savetreesfile=ml.tre;end;MEGA3.1分析其核酸組成1、打開MEGA，點(diǎn)擊“File”中的“OpenData”打開“COI.aln”文件，點(diǎn)擊綠色箭頭－“ConverttoMegaformat”快捷鍵，出一把COI.aln轉(zhuǎn)換成Mega格式的對(duì)話框，點(diǎn)擊OK，即轉(zhuǎn)換成COI的Megafile，保存。2、用Mega打開該文件。選DataType。Protein－codingnucleotidesequencedata？Yes。SelectgeneticCode。程序自行計(jì)算。3、點(diǎn)擊TA圖標(biāo)，出現(xiàn)SequenceDataExplorerC：Conservedsites291/660,分母613是總位點(diǎn)數(shù)V：Variablesites352/660P:Parsimony-informativesites26/660N:Nonparsimony-informativesites352-26＝326。4、Mega-File-opendate-運(yùn)算-sequenceDataExplorer-writedatatofile-title-寫名字.nex注意：序列一定要正確，不能是反向的！?。。。?、打開paup-打開1.nex-open–開始跑樹6、Bootstrap值檢驗(yàn)及樹的保存輸入命令“bootstrapnreps＝1000keepall＝y(tǒng)essearch＝heuristic/addseq＝randomnreps＝100；”點(diǎn)擊回車鍵，程序開始運(yùn)算。運(yùn)算完畢后點(diǎn)擊close彈出一對(duì)話框，輸入命令語句“savetreefile＝文件名.tre；”回車。菜單欄Tree中的Showinternaledgelabels即可顯示各結(jié)點(diǎn)的bootstrap值。7、用treeview打開.tree樹。阿征筆記beginpaup;setautoclose=yesnotifybeep=yes;logfile=log.txt;outgroupA00;setroot=outgroupoutroot=monophyl;setcriterion=parsimony;hsearchaddseq=randomnreps=500nchuck=5chuckscore=1;savetreesformat=nexusbrlens=yesappend=yesfile=mp.treroot=yes;contreeall/file=mp(contree).trestrict=nomajrule=yespercent=50le50=yes;bootstrapnreps=1000conlevel=50keepall=nosearch=heuristic/addseq=randomnreps=100;savetreesfile=mp(bootstrap).treroot=yesbrlens=yessavebootp=bothfrom=1to=1000;end;征征20:31:57我每次都是先寫到contree那一步，然后在里面敲命令，后兩條分別征征20:32:13beginpaup;setautoclose=yesnotifybeep=yes;logfile=log.txt;outgroupA00;setroot=outgroupoutroot=monophyl;setcriterion=parsimony;hsearchaddseq=randomnreps=500nchuck=5chuckscore=1;savetreesformat=nexusbrlens=yesappend=yesfile=mp.treroot=yes;contreeall/file=mp(contree).trestrict=nomajrule=yespercent=50le50=yes;end;征征20:32:25然后bootstrapnreps=1000conlevel=50keepall=nosearch=heuristic/addseq=randomnreps=100;征征20:32:36跑完后savetreesfile=mp(bootstrap).treroot=yesbrlens=yessavebootp=bothfrom=1to=1000;征征20:32:54保存一個(gè)有bootstrap的樹征征20:33:35再給你個(gè)阿榮給我的征征20:33:42setautoclose=yescriterion=parsimonynotifybeep=yes;logfile=...;Hsearchaddseq=randomnreps=100start=stepwisesavereps=yesrandomize=addseqrstatus=yeshold=1swap=tbrmultrees=yes;savetreesformat=nexusbrlens=yesappend=yesfile=...;contreeall/strict=nomajrule=yespercent=50le50=yes;bootstrapnreps=1000conlevel=50keepall=yessearch=heuristic/addseq=randomnreps=10;征征20:34:16對(duì)了，我的outroot=monophyl;你們分子不是monophylPAUP軟件使用簡(jiǎn)要說明1.數(shù)據(jù)輸入格式將需要分析的一組