《腫瘤動(dòng)物模型》課件

腫瘤動(dòng)物模型耿飛鄭雅元2015342056導(dǎo)師孔維腫瘤動(dòng)物模型一.自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型二.誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型三.移植性腫瘤動(dòng)物模型及其研究方法四.人體腫瘤異種移植性腫瘤模型一、自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型定義：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不經(jīng)人為實(shí)驗(yàn)處理而自然發(fā)生的腫瘤，成為自發(fā)性腫瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：高發(fā)病率的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般選用小鼠（mouse）常用腫瘤模型小鼠腫瘤自然發(fā)生率自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)自然發(fā)生，腫瘤發(fā)生學(xué)與細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)與人類腫瘤相似。2.便于慢性治療及綜合治療。3.發(fā)生條件自然，可通過細(xì)致觀察研究發(fā)現(xiàn)新的環(huán)境致癌因素及其他致癌因素；可以著重觀察遺傳因素在腫瘤發(fā)生中的作用。自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型的缺點(diǎn)腫瘤發(fā)生情況參差不齊。難以短時(shí)間內(nèi)獲得大量腫瘤材料，耗時(shí)長，耗資大。發(fā)生腫瘤的動(dòng)物腫瘤生長速度差異大，難以評價(jià)。二、誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型定義：使用致癌因素(Carcinogens)在實(shí)驗(yàn)條件下誘發(fā)動(dòng)物發(fā)生腫瘤的動(dòng)物模型。原理：利用外源性致癌因素引起細(xì)胞遺傳特性異常而呈現(xiàn)出異常生長和高增殖活性，形成腫瘤。用于誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性腫瘤的動(dòng)物種類很多，以嚙齒動(dòng)物的使用最多、應(yīng)用最廣，包括各種大鼠、小鼠、豚鼠等誘發(fā)性腫瘤模型動(dòng)物選擇誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型建立方法原位誘發(fā)致癌物直接與動(dòng)物靶組織或靶器官接觸而誘發(fā)該組織或器官發(fā)生腫瘤。異位誘發(fā)將與致癌物接觸后的動(dòng)物組織或器官埋置于該動(dòng)物或另一正常動(dòng)物皮下而產(chǎn)生的該組織或器官的腫瘤。誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型建立方法致癌物致癌物1.涂抹法（皮膚癌）2.經(jīng)口給藥法（消化道或消化腺)3.注射法4.氣管灌注法（肺癌）5.穿線法6.埋藏法誘發(fā)性腫瘤模型——致癌物給予途徑誘發(fā)性腫瘤模型——舉例[特點(diǎn)]：①DEN總量達(dá)868mg，觀察時(shí)間為100天，發(fā)癌率可達(dá)40％，DEN總量達(dá)1176mg，觀察時(shí)間為半年時(shí)，發(fā)癌率可達(dá)94％，其中支氣管鱗狀細(xì)胞癌占41％。②烏拉坦注后3個(gè)月肺腺癌發(fā)生率為100％，且多數(shù)為多發(fā)性，誘發(fā)肺腫瘤的部位和組織分型與人類肺腫瘤相近似。[特點(diǎn)及應(yīng)用]：DEN誘發(fā)大鼠致癌率為70％．DBA誘癌率為60％，黃曲霉素誘發(fā)大鼠肝癌發(fā)生率為80％，此種方法從病因?qū)W角度分析，與人體腫瘤較為近似，故此類模型常用于腫瘤特點(diǎn)的深入研究。三.移植性腫瘤動(dòng)物模型及其研究方法定義：模型是指將動(dòng)物或人體腫瘤移植到同種或異種動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成移植性腫瘤動(dòng)物的腫瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：移植性腫瘤常用動(dòng)物為小鼠、大鼠和地鼠腫瘤細(xì)胞的選擇：篩選抗癌藥物時(shí)，最好選用3類瘤株，及肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株。在眾多移植性腫瘤中，小鼠Lewis肺癌、小鼠黑色素瘤B16及小鼠白血病P388是目前最受重視和應(yīng)用最廣的。接種方法（無菌操作）1.實(shí)體瘤

制備瘤塊凍存的瘤株

瘤源動(dòng)物

7~10d

增殖獲得瘤塊移入宿主體內(nèi)給動(dòng)物接種受體動(dòng)物實(shí)體瘤接種法：瘤塊接種法、瘤細(xì)胞懸液接種法、培養(yǎng)細(xì)胞接種法、活細(xì)胞接種方法等

瘤塊接種法選取接種后7~10d生長狀態(tài)良好的瘤源動(dòng)物，頸椎脫臼處死，消毒操作部位皮膚。切開皮膚，剝離出接種用的瘤塊，剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長良好而無變性壞死、淡紅色（黑色素瘤則呈黑色或黑紫色）、魚肉裝的瘤組織，在無菌平皿內(nèi)剪成2mm3小塊。平皿放置在冰塊上，平皿內(nèi)放置少許滅菌的PBS或其它營養(yǎng)液。用無菌套管針抽吸瘤塊，接種于同種受體動(dòng)物腋窩皮下（接種部位皮膚應(yīng)先消毒）。也可取出腫瘤后切成小塊，在受體動(dòng)物的腋下剪開一個(gè)小口，用無齒眼科鑷夾取瘤塊，送入切口內(nèi)。腋窩部皮膚松弛，能允許腫瘤生長的較大，宿主動(dòng)物的壽命也可延長。接種操作的時(shí)間盡可能縮短，從瘤塊取材到接種結(jié)束一般應(yīng)在30min內(nèi)完成。

瘤細(xì)胞懸液接種法每次接種的動(dòng)物數(shù)量較多時(shí)可采用此法。具體方法是：無菌操作取出瘤塊，將數(shù)個(gè)瘤塊混合后剪成小塊，放入玻璃勻漿器中，加無菌生理鹽水向一個(gè)方向轉(zhuǎn)動(dòng)研磨后，經(jīng)濾網(wǎng)過濾，加生理鹽水稀釋成1:3~1:4（腫瘤g：生理鹽水ml）的瘤細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼蘭染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，用1ml注射器注射到接種部位，每個(gè)接種點(diǎn)接種0.2ml(一般含1×106~1×107個(gè)細(xì)胞數(shù)）。通常接種到腋窩皮下，每只動(dòng)物可選用多個(gè)接種點(diǎn)。

瘤細(xì)胞懸液接種法將對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化脫壁后，用PBS或者生理鹽水以1000r/min離心10min，洗滌2次，洗掉細(xì)胞中胰蛋白酶和培養(yǎng)液中血清等成分，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，用生理鹽水將腫瘤稀釋成一定濃度的細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液置于冰上，使用1ml注射器在每個(gè)接種點(diǎn)接種0.2ml(含1×106~1×107個(gè)細(xì)胞),應(yīng)盡快注射到接種部位。2.腹水瘤腫瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇對腫瘤細(xì)胞或瘤株進(jìn)行冷凍保存可以使其得以長期使用，防止退化或變異，保存不同代細(xì)胞的特征。一般在液氮中保存1~2年，細(xì)胞存活率可達(dá)80%~90%。1.凍存方法：取對數(shù)生長期增殖旺盛的細(xì)胞，胰蛋白酶消化、離心、洗滌，用含7份培養(yǎng)液、2份小牛血清、1份DMSO配成（1~5）*106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入細(xì)胞凍存管。將凍存管于4℃放置30min,-20℃放置4h，-70℃過夜，然后放入液氮中。2.復(fù)蘇方法：取出凍存管，迅速放入38~40℃水浴中，并不停搖動(dòng)使其在一分內(nèi)全部融化，500~800r/min離心5min,棄上清，加入培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，以后按常規(guī)培養(yǎng)。四.人體腫瘤異種移植性腫瘤模型這種模型使用人的腫瘤細(xì)胞，在病理組織形態(tài)和遺傳特征等方面均與人類腫瘤相同，用這種模型可以比較直接的研究人類腫瘤的生物學(xué)特性及抗腫瘤藥物。常用的宿主動(dòng)物：裸小鼠和C57BL/6小鼠裸小鼠作為移植宿主實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：在SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)繁殖生長的BALB/c裸小鼠，6~8周齡，體重21~22g。瘤源：來源大致分兩類，一類是人的腫瘤細(xì)胞株，另一類是源于人體腫瘤組織快的癌細(xì)胞。常用的人癌裸鼠細(xì)胞株、接種方法和最佳生長期為:結(jié)腸癌HCT-8（勻漿，3周）、胃癌MGC-803(組織塊，4~5周）、肝癌BEL-7402(組織塊，4周）、小細(xì)胞肺癌LTEP-SM1(組織塊，4~5周）、乳腺癌MCF-7(組織塊，4~5周）等操作方法（例：人胃腺癌SGC-7901)：1.超凈臺(tái)內(nèi)將移植瘤剪成2~3mm3大小的瘤塊，用套管針接種在BALB/c裸小鼠右側(cè)腋窩皮下2.接種24h后隨機(jī)分組，開始給予受試藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療，試驗(yàn)周期6周左右3.停藥次日，稱體重，剝?nèi)∧[瘤并稱重，計(jì)算瘤重抑制率。觀察指標(biāo)與療效評價(jià)：1.動(dòng)物在接種腫瘤后6周左右形成1g以上的瘤塊（平均瘤重），則表明移植腫瘤成功2.如出現(xiàn)20%小鼠的瘤重小于400mg，則表示腫瘤生長不良3.在藥物治療期間，如給藥組小鼠死亡率超過20%或剝?nèi)∧[瘤后平均體重下降超過15%（自身對照），表示藥物存在毒性，應(yīng)當(dāng)減量重新實(shí)驗(yàn)4.藥效可根據(jù)給藥后瘤重抑制率來評價(jià)，瘤重抑制率大于30%，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，表示該受試藥有苗頭。重復(fù)3次，如療效穩(wěn)定，評定該藥有一定療效注：腫瘤模型形成時(shí)間較長，需30~40d甚至更長。在異種移植瘤實(shí)驗(yàn)中，還有一種正位移植，即將人癌組織或細(xì)胞按其在人體內(nèi)的原發(fā)部位，接種于相應(yīng)的器官，有別于通常的皮下接種（異位接種）免疫功能抑制的大鼠作為移植宿主實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：體重120~160g的Wistar大鼠操作方法（例：人胃癌細(xì)胞株）：1.大鼠分籠飼養(yǎng)，皮下注射具有免疫抑制作用的阿糖胞苷200mg/kg體重，2d后用10Gy(1000rad)60Co全身照射，照射后的大鼠飼養(yǎng)于潔凈環(huán)境中，每日紫外線燈照射1h，自由攝食飲水，飲水中加土霉素1