TSDYYXH 02-2023 基于斑馬魚模型的藥物早期腎臟毒性快速評(píng)價(jià)方法

ICS11.120.01CCSC10SDYYXH團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/SDYYXH02—2023基于斑馬魚模型的藥物早期腎臟毒性快速評(píng)價(jià)方法Arapidmethodforevaluatingearlynephrotoxicityofdrugsusingzebrafishmodel2023-12-28發(fā)布 2023-12-28實(shí)施山東省醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會(huì)??發(fā)布T/SDYYXH02T/SDYYXH02—2023PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范圍 3規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 3方法原理 4受試物 4儀器設(shè)備 4試驗(yàn)準(zhǔn)備 4試驗(yàn)步驟 5保證試驗(yàn)有效性的條件 6判定標(biāo)準(zhǔn) 6數(shù)據(jù)處理 6試驗(yàn)報(bào)告 6附 錄 A （資料性）斑馬魚典型圖片 8前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由山東省醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會(huì)提出并歸口。本文件主要起草單位：山東省科學(xué)院生物研究所。山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司T/SDYYXH02T/SDYYXH02—2023PAGEPAGE3基于斑馬魚模型的藥物早期腎臟毒性快速評(píng)價(jià)方法范圍本文件適用于基于斑馬魚模型的藥物早期腎臟毒性評(píng)價(jià)。規(guī)范性引用文件（）GB/T39649實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與質(zhì)量控制GB/T21808化學(xué)品魚類延長(zhǎng)毒性14天試驗(yàn)GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。斑馬魚 zebrafish模式動(dòng)物的一種，常用于教學(xué)和科研。生物分類學(xué)上屬于脊索動(dòng)物門、脊椎動(dòng)物亞門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、斑馬魚屬、斑馬魚種。AB系斑馬魚 ABstrainzebrafish實(shí)驗(yàn)室常用斑馬魚品系，由單倍體細(xì)胞經(jīng)早期加壓法獲得。仔魚 larva性腺發(fā)育尚未成熟的斑馬魚。受精后小時(shí)數(shù) hourspost-fertilization（hpf）斑馬魚胚胎體外受精后的小時(shí)數(shù)。眼周水腫 periocularedema斑馬魚雙眼內(nèi)部由于水分分布失衡，液體局部堆積使眼外圍輪廓異常膨大。肌酐 creatinine腎小球尿蛋白 proteinuria尿液中的蛋白質(zhì)含量增加而能夠被檢測(cè)到，反映腎臟濾過(guò)屏障功能情況。10 死度 10 letalcocenrato（L）受試物導(dǎo)致10%受試魚死亡的濃度。15秒內(nèi)沒有心跳判定為死亡。熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Real-timequantitativePCR（RT-qPCR）在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，應(yīng)用熒光化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。方法原理，72hpfnephrinkim1kim1受試物樣品配制水溶性樣品：斑馬魚培養(yǎng)水直接溶解配制成檢測(cè)溶液。非水溶性樣品：選用有機(jī)溶劑、乳化劑或分散劑等進(jìn)行助溶，制備成均勻分散的懸濁液或乳濁液。受試物準(zhǔn)備量10?mg～50?mg。30?mL～50?mL。受試物相關(guān)信息受試物的名稱、來(lái)源、性狀、批號(hào)、規(guī)格、生產(chǎn)日期、保存條件、有效期和配制方法。受試物為單體成分時(shí)，還需要提供該成分相應(yīng)的化學(xué)信息，包括分子量、分子式、分子結(jié)構(gòu)。提供受試物理化性質(zhì)，包含如下信息：在水中或其它溶劑中的溶解性；在水中和光中的穩(wěn)定性；溫度對(duì)受試物穩(wěn)定性的影響。儀器設(shè)備0.0001g。量筒。500mL0.5mL40RTqPR6孔半導(dǎo)體控溫PR0.250～99.9℃。恒溫光照培養(yǎng)箱。精度±1斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)。配備溫控裝置，水循環(huán)和過(guò)濾裝置。水質(zhì)監(jiān)測(cè)設(shè)備。pH試驗(yàn)容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受試物可能吸附于聚苯乙烯容器時(shí)，應(yīng)選用惰性材料（如玻璃）來(lái)減少吸附。低溫高速離心機(jī)。配備致冷控溫裝置，轉(zhuǎn)速≥5000rpm。蛋白凝膠電泳儀。配帶垂直蛋白凝膠電泳槽。0.5mL～50mL。96試驗(yàn)準(zhǔn)備受試斑馬魚72hpf健康A(chǔ)BGB/T39649斑馬魚培養(yǎng)水24h（GB57495mmol/LNaCl、0.17mmo/LKC0.4mmo/LCaC2和0.16mmo/LMgS。14625gNal0.64gKC2.20gCal2和1.72gMgS7HO1000mL5020mL的50980mL1pH6.58.以CaC3計(jì)為10mg/～250mgL6.0mg/。注：此培養(yǎng)水為斑馬魚提供最適生存水環(huán)境。試驗(yàn)溶液配制pH6.5～8.0pHpH6.58.0GB/T218086.3.2pH非水溶性受試物，添加有機(jī)溶劑、乳化劑或分散劑提高受試物溶解度和試驗(yàn)溶液的均勻度。受100mg/L。試驗(yàn)步驟試驗(yàn)分組試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和受試物組，如使用助溶劑，增設(shè)1個(gè)溶劑對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組設(shè)置AB24152mL斑，6505mL溶劑對(duì)照組設(shè)置AB24152mL助溶劑溶液，6孔板中每孔含50尾仔魚和5mL助溶劑溶液。助溶劑溶液濃度為受試物組使用助溶劑的陽(yáng)性對(duì)照組設(shè)置a2mMAB24152mL5μM馬兜a，6505mL5μMa受試物組設(shè)置AB24152mL受6505mL暴露條件28.5124h。注：暴露期間禁止喂食。斑馬魚表型觀察暴露結(jié)束，將仔魚放置載玻片，調(diào)至俯臥位，顯微鏡下觀察仔魚眼部形態(tài)，采集圖像。斑馬魚組織肌酐水平檢測(cè)暴露結(jié)束后，收集仔魚，加入適量體積0.9%NaCl溶液，冰浴下充分勻漿。離心后取上清，過(guò)柱去蛋白，按試劑盒步驟檢測(cè)每組樣品中肌酐含量。斑馬魚尿蛋白檢測(cè)SDS基因檢測(cè)RT-qPCR保證試驗(yàn)有效性的條件90水溶性受試物可配制成澄清溶液，非水溶性受試物可選用二甲基亞砜、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行助溶。斑馬魚圖像采集時(shí)，各組間拍照參數(shù)一致。判定標(biāo)準(zhǔn)受試物組與空白對(duì)照組相比，斑馬魚組織肌酐水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加結(jié)果可作為受試物具有腎毒性的支持證據(jù)，但不替代人體功能檢測(cè)。受試物組與空白對(duì)照組相比，斑馬魚腎病蛋白基因和腎損傷分子基因的表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)分析方法：方差分析（ANOVA）T-test試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告包含下列內(nèi)容：受試物——物理屬性、物理/化學(xué)特性；受試斑馬魚——學(xué)名、品系、來(lái)源、發(fā)育階段、受精卵收集方法及后續(xù)處理；試驗(yàn)條件：光照周期；試驗(yàn)設(shè)計(jì)（試驗(yàn)容器及其平行的數(shù)目，每個(gè)平行中的仔魚數(shù)量）；制備儲(chǔ)備液的方法；若使用助溶劑，應(yīng)給出其成分和濃度；斑馬魚培養(yǎng)水特性：pH試驗(yàn)容器內(nèi)的水質(zhì)：pH喂食情況。試驗(yàn)結(jié)果：斑馬魚頭部照片（A1）；斑馬