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超表達(dá)MfCOR1提高轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性和生物量摘要:黃花苜蓿(Medicagofalcalta)是一種非常耐寒的豆科牧草,是苜??剐杂N的重要基因庫(kù)。在本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了黃花苜蓿響應(yīng)低溫的cDNA消減文庫(kù)基礎(chǔ)上,從中選擇一個(gè)cDNA片段克隆其cDNA全長(zhǎng)605bp,含有579bp的開放閱讀框,編碼一個(gè)由192個(gè)氨基酸組成的蛋白。在GenBank中尚無(wú)與該蛋白同源性高的序列,將編碼該蛋白的基因暫命名為MfCOR1(Medicagofalcaltacoldresponsivegene1)。該蛋白高度親水,N-端含有葉綠體信號(hào)肽,推測(cè)其存在于葉綠體基質(zhì)中。利用半定量RT-PCR技術(shù),分析了該基因在低溫脅迫下的表達(dá)規(guī)律,在低溫處理2-4h時(shí)其表達(dá)已明顯受到誘導(dǎo),低溫處理8-96h后其表達(dá)量一直維持在高水平,初步證明MfCOR1是低溫誘導(dǎo)基因。構(gòu)建了超表達(dá)載體pBI-MfCOR1,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草獲得了轉(zhuǎn)基因植株,經(jīng)過PCR檢測(cè)篩選出51株陽(yáng)性植株,挑選其中15株進(jìn)行Southern雜交分析,結(jié)果表明這些轉(zhuǎn)化植株來(lái)自不同的轉(zhuǎn)化事件。選擇其中3個(gè)單位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因植株T1代幼苗進(jìn)行Southern雜交和RT-PCR檢測(cè),結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因能穩(wěn)定遺傳并且能表達(dá)。進(jìn)一步比較測(cè)定了低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因植株T1代幼苗及其野生型對(duì)照的影響,轉(zhuǎn)基因株系在冷、凍脅迫下相對(duì)電導(dǎo)率的升幅和在冷脅迫下凈光合速率的降幅均低于野生型,表明顯著提高了抗寒性,充分證明MfCOR1是一個(gè)耐寒基因,與植物抗寒性密切相關(guān)。轉(zhuǎn)基因株系還表現(xiàn)為正常生長(zhǎng)條件下苗期生物量顯著增大,這與其具有更高的光合速率有關(guān)。研究結(jié)果表明,MfCOR1是一個(gè)新的耐寒基因,可能參與葉綠體光合作用,提高植物的光合速率,促進(jìn)苗期的生物量積累,是一個(gè)很有應(yīng)用潛力的新基因,可應(yīng)用于改良農(nóng)作物的抗寒性和提高生物產(chǎn)量。關(guān)鍵詞:耐寒基因克隆轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性生物量OverexpressionofMfCOR1inTransgenicTobaccoImprovesColdResistanceandAbstract:MedicagofalcataisakindofLeguminosaeforagegrasseswhichhasstrongtolerancetocoldstress.Becauseofitsgreatresistancetocold,droughtandleanness,Medicagofalcateserveanimportantgenepoolforcropresistancebreeding.ASSHcDNAlibraryofcold-responsivegeneinMedicagofalcatahasbeenestablishedinourlaboratory,inwhichMfCOR1genehasbeenshowntobecold-induced.ThefulllengthofMfCOR1cDNAis605bp,whichcontainsanopenreadingframe(ORF)of579bpandencodesapeptideof192aminoacids,butnoobvioushomologicalsequencehasbeenfoundinGenBank.ThebioinformaticsanalysisindicatsthatthehydrophibicdomainisdominantinthestructureofMfCOR1proteinwhichhasapredictedsignalpeptideofchloroplastandmightbelocalizedinstromaofchloroplast.TheexpressionpatternofMfCOR1wasanalyzedbysemi-quantitativeRT-PCR.TheexpressionofMfCOR1israpidlyinducedinresponsetolowtemperature,andsustainedathighexpressionlevelupto96haftertreatment.Theover-expressionvectorofMfCOR1,pBI-MfCOR1,wasconstructed.ThetransgenictobaccosweregeneratedusingAgrobacterium-mediatedtransformation.Thetransformantplantswereanalyzedusingmoleculardeterminations.PCRdetectionscreens51positiveMfCOR1transgeniclines.15MfCOR1transgenicplantswerefurtheranalyzedbySouthernblot.SouthernblottingindicatesthatMfCOR1integrateintothegenomeoftobaccofromdifferenttransformedcases.SouthernblotandRT-PCRanalysisof3T1plantlinesindicatesthatMfCOR1couldinheritestablyandexpressfullyinthetransgenictobacco.Furtherinvestigationdemonstratethatunderlowtemperaturestressthetransgenictobaccolines,comparedwiththewildtype,hasalowerincreaseincomparativelyconductanceanddecreaseinnetphotosyntheticrate.Thetransgenictobaccosshowedstrongercoldresistancethanthewildtype,andMfCOR1wasfullprovedtobeacoldtolerancegene.TheresultsshowedthatMfCOR1iscloselyrelatedtoplantcoldresistance.Underoptimumgrowthconditions,thetransgenictobaccoshaveahigherbiomassthanwild-typeplants,astheresultoftheincreaseinthenetphotosyntheticrateintransgenictobaccos.TheresultsshowedthatMfCOR1isanovelcoldtolerancegene;itmaybeconcernedwithphotosynthesis,raisephotosyntheticrateandbiomassaccumulationrateinseedlingstage.Inaword,MfCOR1hasgreatapplicationpotentialintheaspectofimprovingcoldresistanceandproduction.Keywords:coldtolerancegenecloningtransgenictobaccocoldresistancebiomass低溫是制約植物生長(zhǎng)、降低其產(chǎn)量的非生物因素之一。低溫不僅在很大程度上限制植物的種植范圍,還會(huì)造成作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降,嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致作物絕收。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年因低溫傷害造成的農(nóng)作物損失高達(dá)數(shù)千億元(Dengetal,2001)。在我國(guó)北方,晚秋和早春時(shí)期發(fā)生的低溫危害常給越冬作物和果木造成嚴(yán)重的傷害。而2008年春節(jié)前后,我國(guó)南方遭受的持續(xù)低溫和冰雪侵襲,更給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大損害。隨著基因工程技術(shù)在作物品種改良方面取得了巨大進(jìn)展,具有可控性強(qiáng)、效率高、周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)的植物基因工程技術(shù)已經(jīng)成為新品種選育的一條全新而有效的途徑(黃文攻等,2006)。因而,隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展,揭示植物耐寒分子機(jī)制,分離和鑒定耐寒基因,有利于廣泛開展抗寒基因工程的研究與應(yīng)用,有效地提高植物的抗寒性,減少低溫傷害造成的經(jīng)濟(jì)損失,具有重要科學(xué)意義與潛在應(yīng)用價(jià)值。黃花苜蓿(MedicagofalcaltaL.),是豆科苜蓿屬多年生草本植物,廣泛分布于亞洲和歐洲,因起源于西伯利亞而具有非常強(qiáng)的耐寒性。同時(shí),還具有抗旱和耐貧瘠等特性,是苜??剐杂N的重要基因庫(kù)。黃花苜蓿草質(zhì)優(yōu)良,適口性好,是我國(guó)北方寒冷地區(qū)的主要優(yōu)良牧草之一,具有重要的飼用價(jià)值、遺傳育種價(jià)值和生態(tài)價(jià)值(王俊杰等,2008)。對(duì)苜蓿低溫脅迫的研究,過去主要著重于形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特性以及不同抗性品種比較等方面(韓瑞宏等,2005),而耐寒分子機(jī)制方面研究不多。已經(jīng)在紫花苜蓿(MedicagosativaL.)和黃花苜蓿鑒定過的低溫馴化特異基因(coldacclimation-specific),包括msaciA、SM2075、SM2201、SM2358、msaCIC、cas15、cas17、cas18(藺忠龍等,2009)。業(yè)已證明,低溫引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度短暫性增加是誘導(dǎo)冷適應(yīng)基因cas15表達(dá)所必需的(Monroyetal,1995)。進(jìn)一步研究揭示,Ca2+通過使蛋白磷酸酯酶失活誘導(dǎo)cas15的表達(dá)(Monroyetal,1998)。最近,通過對(duì)蒺藜苜蓿(MedicagotruncatulaL.)和黃花苜蓿cas15和cas30的啟動(dòng)子比較分析,解釋了這兩個(gè)基因在兩種耐寒性差異較大的材料間響應(yīng)低溫表達(dá)差異的原因,可能與CRT/DRE調(diào)控元件在啟動(dòng)子區(qū)的拷貝數(shù)有關(guān)(Pennycookeetal,2008)。但總的來(lái)說(shuō),目前對(duì)黃花苜蓿耐寒分子機(jī)制研究不多,已鑒定的少數(shù)幾個(gè)cas基因的功能及其調(diào)控抗寒性的機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)室采用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH),構(gòu)建了黃花苜蓿響應(yīng)低溫的cDNA消減文庫(kù),獲得一批受低溫誘導(dǎo)表達(dá)的基因片段(Pangetal,2008)。本研究從黃花苜蓿響應(yīng)低溫的cDNA消減文庫(kù)中選擇1個(gè)cDNA片段(GenBank注冊(cè)號(hào)為ES323184),克隆其cDNA全長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)未知功能的基因,暫命名為MfCOR1。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在煙草中過量表達(dá),并對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行抗寒性、生長(zhǎng)狀況及光合速率分析,為深入研究該基因調(diào)控植物抗寒性的機(jī)制,進(jìn)行作物抗逆基因工程育種打下基礎(chǔ)。材料與方法材料培養(yǎng)與處理黃花苜蓿品種呼倫貝爾(MedicagofalcataL.cv.Hulunbeier)種子用60℃熱水浸泡5min后,在28℃黑暗條件下催芽,露白時(shí)點(diǎn)播于塑料盆中,于溫室內(nèi)培養(yǎng),自然光照,溫度25-28℃。2個(gè)月后將幼苗移入人工氣候箱進(jìn)行低溫(4℃)處理,人工氣候箱光照強(qiáng)度為200μmol/m2s,光周期為14h。分別在處理0、2、4、8、16、24、48及96h后取樣,取樣時(shí)剪取成熟葉片,用錫箔紙包好后投于液氮迅速冷凍,于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成以Trizol法提取總RNA。取0.15g葉片,用液氮快速研磨成粉末,轉(zhuǎn)移至2mL離心管中,加入1.5mLTRE-Trizol(廣州博理生物科技公司)試劑,劇烈振蕩15sec,冰浴5min。10000離心5min,吸取上清至2mL離心管,加入0.3mL氯仿,劇烈振蕩15sec,冰浴10min。12000r/m離心15min,吸取上層水相(≤0.7mL)至1.5mL離心管,依次加入0.4mL異丙醇和0.4mLBufferA(1.2mol/L氯化鈉,80mmol/L檸檬酸鈉,用DEPC處理水配制),立即混勻,室溫下放置10min。12000r/m離心10min,棄上清,用75%乙醇(DEPC處理水配制)洗滌沉淀。7500離心5min,棄上清,再短暫離心3sec,用槍頭吸盡上清。室溫下風(fēng)干沉淀5min,加入30-35μLDEPC處理水,60℃溫浴5min,溶解沉淀。取1-3μL總RNA進(jìn)行甲醛變性膠電泳,檢查RNA的完整性,并測(cè)OD260與OD280,確定總RNA的濃度與純度。參照Promega公司說(shuō)明書,以O(shè)ligo(dT)18為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA第一鏈。μ(100nmol/μL)μLμLμLmol/LμLμLμLμL,1.3設(shè)計(jì)特異引物根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的黃花苜蓿響應(yīng)低溫的cDNA消減文庫(kù)中MfCOR1cDNA序列(注冊(cè)號(hào)為ES323184),在NCBI上進(jìn)行BLASTest,并下載相應(yīng)序列。利用DNAStar軟件的Seqman工具進(jìn)行序列拼接,如此反復(fù)直到拼接得到該基因的全長(zhǎng)序列。通過DNAStar軟件分析以上全長(zhǎng)序列的開放閱讀框,根據(jù)開放閱讀框兩端的序列設(shè)計(jì)上游引物(5’CACAAACTCGAAAAACTTAAGAACCA3’)和下游引物(5’CTTACTCCTTCCCAGCCACGA3’)(由Invitrogen公司合成)。MfCOR1cDNA全長(zhǎng)的克隆與測(cè)序以低溫處理黃花苜蓿葉片的cDNA為模板,利用ExTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得MfCOR1cDNA全長(zhǎng)。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30sec,57℃退火30sec,72℃延伸40sec,30個(gè)循環(huán)。最后72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)片段大小和質(zhì)量。用凝膠回收試劑盒(東盛公司)回收的PCR產(chǎn)物與pMD20-T載體(TaKaRa公司)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株,篩選重組子。得到的重組克?。╬MD-MfCOR1)經(jīng)鑒定后由廣州拓普生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。半定量RT-PCR5’3’5’3’μL反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,MfCOR1植物表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)一對(duì)分別組入XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的引物,pMD1(5’GATCGGATCCGAGGATCTACTAGTCTTATGG3’)和pMD2(5’GTGATCTAGAGCTTGGTACCCAGAAATCCGA3’),以克隆質(zhì)粒pMD-MfCOR1為模板,利用KOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒(東盛公司)回收并定量后,以XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切。酶切體系及方法參考TaKaRa公司商品酶說(shuō)明書。酶切產(chǎn)物以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)試劑盒回收后,克隆到經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切的pBI121植物超表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選重組克隆,并分別進(jìn)行PCR和酶切鑒定。重組質(zhì)粒命名為pBI-MfCOR1。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化模式植物煙草煙草無(wú)菌苗的培養(yǎng)農(nóng)桿菌的活化與懸浮將重組質(zhì)粒pBI-MfCOR1轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105菌株,在YEB平板LL上篩選獲得陽(yáng)性農(nóng)桿菌。使OD600為0.8-1.0。侵染、共培養(yǎng)及抗生素篩選LLLLL轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè)1.8.1PCR按照微量法快速提取轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA,進(jìn)行PCR檢測(cè)。以煙草基因組DNA為模板,使用1.3中上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30sec,57℃退火30sec,72℃1.8.2Southern雜交分析按照CTAB法(Saghaietal,1984)提取轉(zhuǎn)基因及野生型煙草基因組DNA,取50μgDNA,用EcoRI消化后在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,用毛細(xì)管法將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜HybondN+(Amersham公司)。以MfCOR1片段為雜交的探針,用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒進(jìn)行放射性同位素32P標(biāo)記,參照Guo等(2003)的方法進(jìn)行雜交和洗膜。轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性分析1.9.1相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定將表面滅菌的T1代種子點(diǎn)種于MS培養(yǎng)基(含100μg/mL的Kan)上,MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周,進(jìn)行冷、凍處理。將組培苗移到15℃的人工氣候箱中培養(yǎng)1d再以8℃處理3d,光照強(qiáng)度為200μmol/m2s,光周期為14h(冷處理);將組培苗移到15℃的人工氣候箱中培養(yǎng)12h,8℃培養(yǎng)8h,4℃培養(yǎng)4h后,置于-4℃處理3h(凍處理)。處理結(jié)束后,取葉片(約15片)放入含25mL去離子水的三角瓶,在搖床上低速(30r/min)搖動(dòng)2h后,參照Lutts等(1996)的方法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率。光合速率的測(cè)定將以上經(jīng)卡那霉素篩選,在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5周的于溫室內(nèi)培養(yǎng),自然光照,溫度25-28℃,2個(gè)月后于人工氣候箱中進(jìn)行低溫(5℃)處理,以25℃為對(duì)照,光照強(qiáng)度為200μmol/m2s,光周期為14h。分別于處理2、6、8d后進(jìn)行光合速率測(cè)定。在氣溫25℃和大氣CO2濃度約460-490μL/L條件下,用Li-6400便攜式光合儀活體測(cè)定煙草葉片凈光合速率(Pn)。測(cè)定時(shí)內(nèi)置光源光強(qiáng)為900μmol/m2s。野生型和轉(zhuǎn)基因植株各測(cè)定3株,每株系測(cè)定3次1.10統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)的方差分析用SPSS13.0軟件進(jìn)行,采用最小顯著差數(shù)法(LeastSignificantDifference,簡(jiǎn)稱LSD法),顯著性水平為P≤0.05。文中所有柱形圖的柱上方字母相同表示差異不顯著,不同表示差異顯著。2結(jié)果與分析2.1MfCOR1的克隆和序列分析從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的黃花苜蓿響應(yīng)低溫的cDNA消減文庫(kù)中選擇1個(gè)低溫誘導(dǎo)的cDNA(ES323184),根據(jù)其序列及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中MedicagotruncatulasynucleinmRNA的序列,利用DNAStar軟件的Seqman工具進(jìn)行序列拼接,如此反復(fù)拼接得到該基因的cDNA全長(zhǎng)序列。通過DNAStar軟件分析以上全長(zhǎng)序列的開放閱讀框,根據(jù)開放閱讀框兩端的序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物。利用RT-PCR從低溫(4℃)處理黃花苜蓿葉片cDNA中擴(kuò)增出一條600bp左右的帶,將其回收后克隆到pMD20-T載體上。經(jīng)過序列測(cè)定,表明所獲得的cDNA全長(zhǎng)為605bp,含579bp的開放閱讀框,編碼一個(gè)由192個(gè)氨基酸組成的蛋白(圖1)。將該cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列與已知的植物氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析,未發(fā)現(xiàn)與其高度同源的序列。進(jìn)一步對(duì)同源性相對(duì)較高的幾個(gè)蛋白進(jìn)行同源性比較,構(gòu)建了進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果表明,本研究所克隆的基因是一個(gè)未知功能的基因。由于其來(lái)自于黃花苜蓿(M.falcalta),并受低溫誘導(dǎo),故暫命名為MfCOR1(Medicagofalcaltacoldresponsivegene1)。圖1MfCOR1的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列(注:出于保密原因,該序列尚未在GenBank注冊(cè))圖2MfCOR1的進(jìn)化樹構(gòu)建利用ProtParamtool軟件預(yù)測(cè)MfCOR1編碼的蛋白質(zhì),其理論分子量為20.0kD,理論等電點(diǎn)(TheoreticalpI)為5.10,是一種偏酸性的小分子量蛋白質(zhì)。MfCOR1富含丙氨酸(18.8%)、賴氨酸(10.9%)、蘇氨酸(9.9%)、甘氨酸(7.3%)等親水性氨基酸,而疏水性氨基酸如酪氨酸含量很低(1.6%)。使用軟件ProtScale對(duì)MfELIP氨基酸序列的疏水性/親水性預(yù)測(cè),依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)和分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律,可以看出,MfCOR1具有高親水性,親水性氨基酸分布均勻,中部有2個(gè)親水性特別強(qiáng)的區(qū)域(圖3)。使用iPSORTPrediction對(duì)MfCOR1進(jìn)行的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),表明在N-端有一個(gè)葉綠體信號(hào)肽(圖4)。根據(jù)以上結(jié)果,推測(cè)MfCOR1存在于葉綠體基質(zhì)中。圖3MfCOR1的疏水性/親水性預(yù)測(cè)圖4MfCOR1的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)2.2低溫脅迫對(duì)MfCOR1表達(dá)的影響在低溫(4℃)處理2-4h時(shí)MfCOR1的表達(dá)已明顯受到誘導(dǎo),處理8-96h后MfCOR1的表達(dá)量一直維持在高水平(圖5)。結(jié)果初步證明MfCOR1是低溫誘導(dǎo)基因,表明該基因表達(dá)可能與黃花苜蓿的耐寒性有關(guān)。圖5低溫(4℃)對(duì)黃花苜蓿葉片中2.3超表達(dá)MfCOR1的轉(zhuǎn)基因煙草培育及鑒定將MfCOR1連接到表達(dá)載體pBI121上,構(gòu)建成過量表達(dá)載體pBI-MfCOR1。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草,共獲得了58株抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因再生植株。對(duì)它們進(jìn)行了PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,大部分植株都能擴(kuò)增出一條與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的條帶,51株表現(xiàn)為PCR陽(yáng)性(圖6)。進(jìn)一步選取其中15株P(guān)CR陽(yáng)性植株,進(jìn)行Southern雜交分析,以MfCOR1基因主體片段為探針。結(jié)果顯示,編號(hào)為W的野生型對(duì)照沒有雜交信號(hào),而轉(zhuǎn)基因植株中除編號(hào)為9的株系為陰性外,其它14株均有強(qiáng)烈的雜交信號(hào)(圖7)。由于MfCOR1基因序列上沒有EcoRⅠ酶切位點(diǎn),因此Southern雜交信號(hào)的條帶數(shù)等于MfCOR1在轉(zhuǎn)基因煙草基因組的插入位點(diǎn)數(shù)。結(jié)果表明,MfCOR1在編號(hào)為1、3、4、5、6、7、11、13、14的煙草植株基因組中以單位點(diǎn)的形式插入,在編號(hào)為10、12、15的煙草基因組中以雙位點(diǎn)的形式插入,以3位點(diǎn)的形式插入了編號(hào)為2、8的煙草基因組中。Southern雜交結(jié)果還表明,該基因分別以不同插入位點(diǎn)數(shù)插入煙草基因組的不同位置,這14株轉(zhuǎn)基因煙草分別來(lái)自不同的轉(zhuǎn)化事件。圖6部分轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定M,MarkerDL5000;1-17,轉(zhuǎn)基因煙草植株;P,質(zhì)粒pBI-MfCOR1;W,野生型煙草圖7部分轉(zhuǎn)基因煙草的Southern雜交分析1-15,轉(zhuǎn)基因煙草植株;M,λDNA/HindⅢMarker;W,野生型煙草;P,質(zhì)粒pBI-MfCOR1進(jìn)一步對(duì)其中3個(gè)單位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因株系(編號(hào)為5、11、13)T1代植株進(jìn)行Southern雜交分析,各隨機(jī)挑選3株。結(jié)果顯示,MfCOR1在各株系T1代煙草基因組中均以單位點(diǎn)的形式插入,并且同一株系不同植株間具有相同的插入位置(圖8a)。結(jié)果表明,MfCOR1在轉(zhuǎn)基因煙草中穩(wěn)定遺傳。采用RT-PCR檢測(cè)此3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系T1代植株及野生型對(duì)照的MfCOR1mRNA,結(jié)果顯示編號(hào)為W的野生型對(duì)照沒有條帶,而3個(gè)轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)到MfCOR1的mRNA(圖8b)。結(jié)果表明,MfCOR1在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中表達(dá)。圖8T1代轉(zhuǎn)基因煙草的Southern雜交和RT-PCR分析51113,轉(zhuǎn)基因煙草株系;M,λDNA/HindⅢMarker;W,野生型煙草T1代轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性分析通過比較測(cè)定低溫脅迫下以上3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的T1代植株及其野生型對(duì)照的相對(duì)電導(dǎo)率以及凈光合速率,分析T1代轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性。2.4.1低溫對(duì)煙草相對(duì)電導(dǎo)率的影響5周齡煙草經(jīng)8℃冷處理4d和-4℃凍處理3h后,野生型對(duì)照植株葉片嚴(yán)重脫水萎蔫,并且部分葉片半黃半綠,而轉(zhuǎn)基因煙草葉片受傷害程度較輕,只有部分葉片輕度萎蔫(圖9)。在常溫下,轉(zhuǎn)基因煙草與野生型對(duì)照葉片的相對(duì)電導(dǎo)率很低,為6%左右。而經(jīng)8℃冷處理4d后,野生型對(duì)照葉片相對(duì)電導(dǎo)率升高為30.5%,而轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)電導(dǎo)率明顯低于野生型對(duì)照,分別為17.7%、18.3%、16.5%(圖10a)。經(jīng)-4℃凍處理3h后,野生型對(duì)照葉片相對(duì)電導(dǎo)率升高為30.2%,而轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)電導(dǎo)率分別為13.4%、12.6%、13.0%,明顯低于野生型對(duì)照(圖10b)。上述結(jié)果說(shuō)明,在冷、凍處理后,轉(zhuǎn)基因煙草質(zhì)膜受損程度明顯低于野生型對(duì)照,圖9冷(8℃)、凍處理(-4℃)對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的影響圖10冷、凍處理對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)電導(dǎo)率的影響a:冷(8℃)處理4d;b:凍(-4℃)處理3h低溫對(duì)煙草光合速率的影響對(duì)3月齡煙草進(jìn)行低溫(5℃)處理,以常溫(25℃)為對(duì)照,測(cè)定光合速率。結(jié)果顯示,在正常生長(zhǎng)條件下,轉(zhuǎn)基因植株凈光合速率(Pn)顯著高于野生型對(duì)照,分別比野生型對(duì)照高出9%、15%、12%(圖11)。常溫對(duì)照處理中,各株系的凈光合速率隨時(shí)間的變化不大(圖11a)。而低溫處理導(dǎo)致凈光合速率的明顯降低,野生型株系降幅最大,低溫處理8d后降到其對(duì)照的54%,而轉(zhuǎn)基因株系分別為其對(duì)照的84%、71%、60圖11低溫處理對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因煙草光合速率的影響a:常溫(25℃);b:低溫(5℃)T1代轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的生長(zhǎng)情況在培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因煙草幼苗過程中,發(fā)現(xiàn)正常生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)基因煙草長(zhǎng)勢(shì)明顯好于野生型。對(duì)比5周齡苗,轉(zhuǎn)基因煙草株高較野生型高,葉片較野生型大,根系較野生型發(fā)達(dá)(圖12)。測(cè)定結(jié)果顯示,T1代轉(zhuǎn)基因煙草地上部、根系及植株鮮重都明顯地高于野生型,植株鮮重分別為野生型對(duì)照的1.7、2.8、1.7倍(圖13a)。葉面積也明顯大于野生型,分別為野生型對(duì)照的1.6、2、1.8倍(圖13b)。圖12正常條件下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草組培苗生長(zhǎng)狀況(5周齡苗)圖13正常條件下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草組培苗生理指標(biāo)(5周齡苗)a:植株各部分鮮重;b:葉面積為進(jìn)一步比較正常生長(zhǎng)條件下植株大小,在5周齡時(shí),將各實(shí)驗(yàn)株系幼苗移至含MS培養(yǎng)基的250mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),每瓶種一株,每株系重復(fù)5株。比較觀察9周齡苗的生長(zhǎng)情況,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草明顯比野生型高大,無(wú)論是地上部還是根系均優(yōu)于野生型,而且轉(zhuǎn)基因植株側(cè)根繁多(圖14)。測(cè)定結(jié)果顯示,T1代轉(zhuǎn)基因煙草地上部、根系及植株重量都大大高于野生型對(duì)照,分別是野生型對(duì)照的2.1、4.6、2.4倍(圖15)。圖14正常條件下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草組培苗生長(zhǎng)狀況(9周齡苗)圖15正常條件下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草組培苗生理指標(biāo)(9周齡苗)同時(shí),將5周齡的轉(zhuǎn)基因植株及其野生型對(duì)照幼苗移栽到培養(yǎng)盆中,在溫室自然光照下生長(zhǎng),轉(zhuǎn)基因株系幼苗的生長(zhǎng)狀況同樣明顯優(yōu)于野生型。整體上,轉(zhuǎn)基因煙草較野生型更健壯,個(gè)體更大(圖16)。結(jié)果表明,在正常生長(zhǎng)條件下,無(wú)論是無(wú)菌苗還是盆栽幼苗,轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)顯著優(yōu)于野生型對(duì)照。圖16正常條件下煙草盆栽苗生長(zhǎng)狀況a,9周齡苗;b,13周齡苗3討論與結(jié)論植物遭受低溫脅迫后,數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)會(huì)受誘導(dǎo)(Fowleretal,2002),多條調(diào)節(jié)途徑參與了植物抗寒性的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了黃花苜蓿冷響應(yīng)抑制性消減雜交文庫(kù),從中篩選出100多個(gè)陽(yáng)性克隆,將陽(yáng)性克隆對(duì)應(yīng)基因編碼的蛋白分為調(diào)控蛋白、與損傷修復(fù)或生長(zhǎng)相關(guān)的功能蛋白以及功能未知蛋白三大類。本研究從該cDNA文庫(kù)中克隆了一個(gè)響應(yīng)低溫的未知功能基因cDNA全長(zhǎng),暫命名為MfCOR1。MfCOR1預(yù)測(cè)分子量為20kD,具有高度的親水性,其N-端含葉綠體信號(hào)肽,推測(cè)MfCOR1存在于葉綠體基質(zhì)中,可能在光合系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)與調(diào)節(jié)中起作用。Weiser等(1970)最先提出植物抗寒性誘導(dǎo)過程中基因表達(dá)發(fā)生改變的觀點(diǎn),揭示出植物抗寒鍛煉實(shí)質(zhì)上是感受低溫信號(hào)、調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和代謝的環(huán)境適應(yīng)過程。MfCOR1的表達(dá)受低溫誘導(dǎo),低溫(4℃)處理2h后就明顯上調(diào),8h后一直維持高水平的表達(dá)。初步證明MfCOR1是低溫誘導(dǎo)基因,表明該基因表達(dá)可能與黃花苜蓿的耐寒性有關(guān)。為驗(yàn)證MfCOR1在提高植物耐寒性中的作用,進(jìn)一步將MfCOR1在煙草中過量表達(dá),本文共獲得了51株轉(zhuǎn)基因煙草,對(duì)其中15株進(jìn)行了Southern雜交檢測(cè),證明MfCOR1以單位點(diǎn)、雙位點(diǎn)或多位點(diǎn)形式整合到了煙草基因組中。選擇其中3個(gè)單位點(diǎn)(株系編號(hào):5、11、13)的轉(zhuǎn)基因植株T1代幼苗進(jìn)一步進(jìn)行Southern雜交檢測(cè),它們均以單位點(diǎn)形式整合到了煙草基因組中,證明轉(zhuǎn)基因能穩(wěn)定遺傳。RT-PCR結(jié)果證明,在各株系的3株幼苗中,MfCOR1均能表達(dá)。植物受到低溫脅迫后細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)遭受破壞,膜破壞的程度隨低溫脅迫的加劇而增加,并可以通過細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲率的大小來(lái)反映。因此,比較電解質(zhì)外滲率的大小是間接評(píng)價(jià)植物應(yīng)對(duì)低溫脅迫能力的一種有效途徑(Ameglioetal,2003)。光合作用同樣也是植物受低溫影響最明顯的過程之一,植物在低溫脅迫下都顯示出光合速率的明顯下降(王國(guó)莉等,2005;Zhouetal,2006)。比較測(cè)定了低溫脅迫對(duì)3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的T1代植株及其野生型對(duì)照相對(duì)電導(dǎo)率和凈光合速率的影響,結(jié)果表明,冷脅迫或凍脅迫處理后植株的相對(duì)電導(dǎo)率明顯升高,而轉(zhuǎn)基因植株顯著低于野生型;冷脅迫下植株光合速率降低,而轉(zhuǎn)基因植株降幅低于野生型。研究證明,過量表達(dá)MfCOR1的轉(zhuǎn)基因煙草耐寒性明顯提高,充分證明MfCOR1是一個(gè)耐寒基因,其表達(dá)與植物抗寒性密切相關(guān)。雖然MfCOR1提高植物抗寒性的詳細(xì)機(jī)理有待于進(jìn)一步研究,由于MfCOR1定位于葉綠體基質(zhì),推測(cè)它可能對(duì)CO2同化過程或該過程的關(guān)鍵酶起調(diào)節(jié)作用,而且轉(zhuǎn)基因煙草在正常條件下比野生型具有更高的光合速率也證明了這一點(diǎn)。本文還發(fā)現(xiàn)在正常生長(zhǎng)條件下,過量表達(dá)MfCOR1的轉(zhuǎn)基因煙草長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于野生型植株,表現(xiàn)在株高、葉面積、根系和生物量等方面高于野生型。這可能與過量表達(dá)MfCOR1后轉(zhuǎn)基因煙草提高了光合速率,促進(jìn)了植株生長(zhǎng)和干物質(zhì)積累有關(guān)。在對(duì)轉(zhuǎn)FBA基因魚腥藻的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,轉(zhuǎn)基因魚腥藻的光合速率和生長(zhǎng)速率顯著提高(馮燕等,2006)。光合作用速率的提高使得有機(jī)物的積累增加,同時(shí)也使得轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)速率得到了顯著的提高。光合作用是決定作物產(chǎn)量最重要的因素之一,作物中90%以上的干重直接來(lái)源于光合作用。因此,光合作用效率的高低直接關(guān)系到作物的產(chǎn)量。與此同時(shí),低溫逆境是植物生長(zhǎng)與產(chǎn)量的重要限制因素。而本研究中發(fā)現(xiàn)的MfCOR1不僅在提高植物抗寒性方面有重要作用,同時(shí)也提高了植物的生物量。本研究為利用該基因改造其他經(jīng)濟(jì)作物提供有益的探索,為利用基因工程技術(shù)進(jìn)行作物品種改良打下基礎(chǔ),具有重要的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。[參考文獻(xiàn)]王國(guó)莉,郭振飛.水稻不同耐冷品種光呼吸對(duì)低溫的反應(yīng).作物學(xué)報(bào),2005,31(5):673-676王俊杰,云錦鳳,呂世杰.黃花苜蓿種植的優(yōu)良特性與利用價(jià)值.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(1):215-219馮燕,陳曉,施定基等.水稻胞質(zhì)FBA基因在魚腥藻7120中的表達(dá)及其對(duì)光合作用的調(diào)控.植物研究,2006,26(6):691-698韓瑞宏,盧欣石,余建斌等.苜??购匝芯窟M(jìn)展.中國(guó)草地,2005,27(2):60-65黃文攻,殷奎德,高中超.植物抗凍基因工程研究進(jìn)展.生物技術(shù)通報(bào),2006,(2):1-4藺忠龍,李維薇,白現(xiàn)廣等.植物抗凍基因最新研究進(jìn)展.北方園藝,2009,(1):119-123AmeglioT,PigeonD,ArchillaO.Adaptationtocoldtemperatureandresponsetofreezinginroses.ActaHort,2003,618:515-520DengJ,JianL.Advancesofstudiesonplantfreezing-tolerancemechanism:freezingtolerancegeneexpressionanditsfunction.ChineseBullerinofBotany,2001,18(5):521-530FowlerS,ThomashowM.ArabidopsistranscriptomeprofilingindicatesthatmultipleregulatorypathwaysareactivatedduringcoldacclimationinadditiontotheCBFcoldresponsepathway.PlantCell,2002,14(8):1675-1690GuoZ,BonosS,MeyerW,etal.Transgeniccreepingbentgrasswi

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