DB21-T 2743-2017動物源細菌抗菌藥物敏感性檢測

ICS07.100

B41

備案號：58401-2018DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T2743—2017

動物源細菌抗菌藥物敏感性檢測

Bacterialantimicrobialsusceptibilitytestingofanimalorigin

DB21/T2743—2017

動物源細菌抗菌藥物敏感性檢測

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物源細菌常見藥物的微量肉湯稀釋法藥物敏感性試驗所需的試劑和材料、儀器設(shè)

備、操作步驟和質(zhì)量控制。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于動物源非苛氧菌常見抗菌藥物的微量肉湯稀釋法藥物敏感性試驗。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3原理

微量肉湯稀釋法是定量檢測某一抗菌藥物對動物源細菌的體外抑菌活性的一種標(biāo)準(zhǔn)方法。在每塊藥

敏板上，都設(shè)有一系列稀釋濃度的抗菌藥物試劑，及陽性對照和陰性對照，通過加入待檢細菌的菌懸液，

經(jīng)一定時間的孵育后，用微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)或肉眼判讀的方法對藥敏板條進行讀數(shù)，經(jīng)數(shù)據(jù)分析

得到最小抑菌濃度（MIC）值。

試劑和材料

4試劑和材料

4.1化學(xué)試劑

除非另有說明，使用的試劑為分析純或生化試劑，所有實驗室使用的試劑等級應(yīng)為不含微生物的分

析純試劑，試劑的選購、驗收、儲存應(yīng)符合規(guī)定。

4.2實驗用水

除非另有規(guī)定，實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中三級水的規(guī)格。

4.3瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.1。

4.4Mueller-Hinton肉湯（M-H肉湯）培養(yǎng)基：見附錄A中A.2。

4.50.85%無菌生理鹽水

稱取8.50g（精確到0.01g）分析純氯化鈉，加入1L蒸餾水溶解后121℃15min高壓滅菌。

4.6抗菌藥物

1

DB21/T2743—2017

使用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?，參照中華人民共和國獸藥典或CLSI的M07-A10、M37-A3和M45-A3進行溶解。

4.7藥敏檢測板

按產(chǎn)品說明進行操作使用。

4.8質(zhì)控菌株

應(yīng)選用來自國家級微生物菌種保藏中心的標(biāo)準(zhǔn)菌株或具有資質(zhì)的菌種保藏機構(gòu)提供的分類明確的

菌株。質(zhì)控菌株的使用代次為3~5代，質(zhì)控菌株應(yīng)至少30天更換一次，由凍干或超低溫冷凍保存菌種移

種或購買新菌種。

5儀器設(shè)備

5.1恒溫培養(yǎng)箱：精度36±1℃。

5.2分析天平：感量為0.01g和0.00001g。

5.3無菌操作臺：可滿足無菌要求的生物安全柜、超凈臺或無菌室等。

5.4多道移液器：量程20~200μL、100~1000μL、1000~10000μL。

5.5麥?zhǔn)媳葷醿x：量程0～5MCF。

5.6自動加樣器。

5.7藥敏結(jié)果判定儀。

6測定程序

動物源細菌抗菌藥物敏感性檢測程序見圖1。

動物源細菌抗菌藥物敏感性檢測

質(zhì)控菌株測試菌株

抗菌藥物工作溶液制備

菌落培養(yǎng)

菌懸液制備

菌懸液接種

36±1℃培養(yǎng)

判定結(jié)果

圖1動物源細菌抗菌藥物敏感性檢測程序圖

2

DB21/T2743—2017

7操作步驟

7.1菌落培養(yǎng)

接種的菌落由新鮮的劃線平板菌落來制備，按要求選擇瓊脂培養(yǎng)基平板進行接種，除特殊要求培養(yǎng)

時間不超過24小時。

7.2菌液制備

用接種環(huán)挑取瓊脂平板上培養(yǎng)16～18小時的3～5個單菌落，用0.85%無菌生理鹽水或M-H肉湯稀釋

至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬簼舛燃s為1～2×108CFU/mL。

7.3抗菌藥物工作溶液的制備

7.3.1溶劑和稀釋液

用于制備抗菌藥物儲備液的溶劑和稀釋液，除蒸餾水可高壓滅菌外，其余應(yīng)采用0.22μm微孔濾膜

過濾除菌。

7.3.2抗菌藥物儲備液的制備

抗菌藥物儲備液的濃度應(yīng)至少為最高測試濃度的10倍或者1000μg/mL以上，但對于某些溶解性低的

抗菌藥物可以制備較低濃度的儲備液。

7.3.3抗菌藥物工作溶液的制備

將抗菌藥物儲備液用M-H肉湯稀釋至一定的工作濃度后，按倍比稀釋法進一步稀釋至一系列所需濃

度(一般10個濃度梯度)，然后按順序用多道移液器點入96孔板中，每塊板橫向10個稀釋度，每孔0.1mL，

設(shè)陰性和陽性對照。

7.4菌液接種

將調(diào)節(jié)至0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木河肕-H肉湯稀釋100倍，混勻備用。使用多道移液器吸取菌液0.1mL

分別加入含系列抗菌藥物溶液的藥敏板中，或采用自動上樣器進行接種，陰性對照孔除外，陽性對照為

菌液0.1mL。陰性對照孔中加入0.1mL水解酪蛋白肉湯，蓋好板蓋。

7.5培養(yǎng)

將加有菌液和抗菌藥物的板，置36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18小時。

7.6結(jié)果判定

取出培養(yǎng)后的藥敏板，先觀察陰性和陽性結(jié)果，陰性對照孔應(yīng)無細菌生長，孔內(nèi)液體未見渾濁；陽

性對照孔應(yīng)有細菌生長所形成的圓形或者網(wǎng)狀沉淀。如果陰性和陽性對照結(jié)果正常，繼續(xù)觀察其余孔內(nèi)

細菌生長情況，無細菌生長的孔內(nèi)所含最低抗菌藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）?；虿捎盟幟艚Y(jié)果

判定儀進行判定。

7.7質(zhì)量控制

在質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度符合規(guī)定范圍的前提下，按判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷被檢菌株的敏感性－敏感

（S）、中度敏感（I）或耐藥（R）。對于只給出敏感判斷標(biāo)準(zhǔn)的藥物，只報告其是否敏感即可。可參

3

DB21/T2743—2017

考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會CLSI的M07-A10、M37-A3和M45-A3的要求進行質(zhì)量控制，按CLSI的

M100-S26和M31-A3的臨床折點判斷標(biāo)準(zhǔn)進行耐藥性判讀和結(jié)果分析。

7.8結(jié)果報告

驗結(jié)果的報告包括受試藥物對實驗菌株的MIC、質(zhì)控菌株的MIC和實驗菌株的名稱、來源、孵育時

間。

4

DB21/T2743—2017

AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基

除非特殊注明，所用試劑均為分析純；實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中三級水的規(guī)格。

A.1瓊脂培養(yǎng)基

A.1.1成分

蛋白胨10.0g

牛肉膏3.0g

氯化鈉5.0g

瓊脂15.0g~20.0g

蒸餾水1000mL

A.1.2制法

將除瓊脂外的各成分溶于蒸餾水中，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL校正pH至7.2~7.4。加入瓊脂，加

熱煮沸，使瓊脂溶化。分裝三角瓶，121℃高壓滅菌20min。有特殊生長要求的細菌應(yīng)添加輔助生長試

劑。

A.2Mueller-Hinton肉湯（M-H肉湯）培養(yǎng)基

A.2.1成分

牛肉粉2.0g

可溶性淀粉1.5g

酸水解酪蛋白17.5g

蒸餾水1000mL

A.2.2制法

將各成分溶于蒸餾水中，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL校正pH至7.2~7.4。加熱煮沸，分裝三角瓶，

121℃高壓滅菌15min。有特殊生長要求的細菌應(yīng)添加輔助生長試劑，應(yīng)含有20mg/L~25mg/LCa2+和

10mg/L~12.5mg/LMg2+。

_________________________________

5

DB21/T2743—2017

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心和中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所聯(lián)合提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所