DB21-T 2944-2018辣椒品種純度SSR分子標記鑒定技術規(guī)程

ICS65.020.01

B21DB21

備案號：60672-2019

遼寧省地方標準

DB21/T2944—2018

辣椒品種純度

SSR分子標記鑒定技術規(guī)程

Regulationsforthepurityidentificationofpepper

varietiesbySSRmolecularmarkers

DB21/T2944-2018

辣椒品種純度SSR分子標記鑒定技術規(guī)程

1范圍

本標準規(guī)定了辣椒品種純度SSR分子標記鑒定技術的儀器設備及試劑，鑒定方法，結果

計算。

本標準適用于辣椒品種一代雜交種子制種過程中由于混入母本種子導致純度降低的純

度鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本

適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T3543.2農作物種子檢驗規(guī)程扦樣

3術語和定義

下列術語及定義適用于本標準。

3.1

品種純度VarietiesPurity

品種在特征特性方面典型一致的程度，本標準中指品種在SSR分子標記帶型方面典型一

致的程度，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占供檢樣品種子總粒數(shù)的百分率表示。

3.2

分子標記MolecularMarker

以蛋白質，核酸等生物大分子的多態(tài)性為基礎，顯示生物遺傳差異的標記。

3.3簡單重復序列SimpleSequenceRepeat（SSR）

又被稱為微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個堿基（1-6個）為重復單位聚集而成的長達幾十個

至幾百個堿基的串聯(lián)重復序列，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。

3.4

SSR分子標記SSRMolecularMarker

簡單重復序列（SSR）在同一物種的不同基因型間具有高度多態(tài)性，根據(jù)其側翼的保守

堿基序列設計引物，通過PCR擴增，利用電泳技術獲得的多態(tài)性帶型，即SSR分子標記。

4原理

SSR廣泛分布于辣椒基因組中，根據(jù)SSR分子標記在遺傳上的多態(tài)性，共顯性等特點，通

過比較辣椒品種單粒種子間在SSR分子標記上一致性程度，可以鑒定品種純度。

2

DB21/T2944-2018

鑒于生產上一代雜交種子的純度問題通常由混入母本自交的種子導致。一代雜交種子的

種皮由母本組織發(fā)育而來，其基因型為母本基因型，而一代雜交種子的胚由雙親生殖細胞結

合后的受精卵發(fā)育而來，其基因型為雙親基因型。因此，一代雜交種子的種皮與胚的DNA不

同，可用于篩選母本與一代雜交種子在SSR分子標記上的差異。

5儀器設備及試劑

5.1儀器設備

恒溫水浴鍋；PCR儀；垂直電泳槽；電泳儀；萬分之一電子天平；移液器；振蕩器；高

速離心機；紫外-可見成像系統(tǒng)；水平搖床；高壓滅菌鍋；pH計等。

5.2試劑

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；鹽酸（HCl，36%）；十六

烷基三甲基溴化銨（CTAB）；氯化鈉（NaCl）；氫氧化鈉（NaOH）；硼酸（H3BO3）；甲叉雙丙烯

酰胺；丙烯酰胺；無水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；過硫酸銨（APS）；硝酸銀（AgNO3）；

甲醛溶液（37%）；PCR預混液（2×TaqPCRMix）；SSR引物等。

5.3溶液配制

相關溶液配制方法見附錄A。

6鑒定方法

6.1取樣

按照GB/T3543.2規(guī)定的方法扦樣，從送檢樣品中隨機取不少于105粒種子。

6.2DNA提取

6.2.1樣品前處理

取105粒種子，其中100粒種子用于純度鑒定，以單粒分別置于研缽中，加入液氮后研磨，

將粉末分別置于2mL離心管中；其中5粒種子用于篩選母本與一代雜交種子的差異引物，用去

離子水浸泡16h，分別剝取種皮及胚，將5粒種子的種皮及胚分別混合后置于研缽，加入液氮

后研磨，將粉末分別置于2mL離心管中。

6.2.2細胞裂解

在上述離心管中分別加入1mL裂解液，振蕩混勻后，65℃水浴40min，期間每隔10min混

勻一次。

6.2.3DNA沉淀

裂解處理后，12000r離心2min，取上清液600μL移入新的2mL離心管中，加入等體積異

丙醇，混勻后于室溫下靜置2min，12000r離心2min，棄上清液，在通風櫥中開蓋放置使異丙

醇揮發(fā)。

6.2.4DNA回溶

加入200μL超純水使沉淀溶解，即得到DNA粗提液。

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DB21/T2944-2018

注：以上為推薦的一種DNA提取方法。所獲DNA質量能夠符合PCR擴增需要的DNA提

取方法都適用于本標準。

6.3PCR擴增

6.3.1反應體系

10μL反應體系：5μL2×TaqPCRMix（含染料），1μL引物（10μmol/L），2μLDNA，

2μL超純水，混勻。

6.3.2反應程序

94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃延伸

5min；4℃保存。

6.4電泳檢測

6.4.1凝膠制作

將玻璃板洗凈，用無水乙醇擦兩遍，晾干。取8%丙烯酰胺膠80mL，加入TEMED80μL和

10%過硫酸銨400μL，迅速混勻后灌膠，灌膠過程中防止氣泡產生。灌膠結束后，將梳子輕

輕的插入膠中，15min左右拔下梳子，待凝膠聚合1h以上之后再上樣。

6.4.2電泳

每個加樣孔加入3μL的PCR產物。80W恒功率電泳至電泳指示劑到達膠板的中下部。

6.5銀染

電泳結束后，小心分開兩塊玻璃板，取出凝膠，去離子水快速漂洗1次，不超過1min；

染色液中染色15min；去離子水漂洗5min；顯影液中輕輕晃動直至帶紋清晰；去離子水漂洗

1min。將凝膠置于可見-紫外成像系統(tǒng)拍照。

6.6分子標記篩選

用SSR引物（見附錄B）進行PCR反應，擴增送檢樣品胚及種皮DNA，篩選帶型清晰，差異

明顯的引物作為純度鑒定的SSR分子標記。

6.7純度鑒定

用篩選出來的SSR引物對100粒樣品種子的DNA進行PCR擴增，統(tǒng)計具有本品種特異帶型的

種子粒數(shù)。

7結果計算

用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占供檢樣品種子總粒數(shù)的百分率表示純度，計算公式

如下：

具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)

純度%100%..........................(1)

供檢樣品種子總粒數(shù)

4

DB21/T2944-2018

AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

溶液配制

A.1裂解液

含有100mmol/LTris-HCl（pH8.0），1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，2%CTAB，經高

壓蒸汽滅菌后使用。

A.2引物稀釋

按照引物合成單的說明先配制100μmol/L的儲存液，取適量儲存液稀釋10倍，配制濃度

為10mmol/L的使用液。

A.310倍電泳緩沖液

Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液37mL，定容至1000mL。

A.48%丙烯胺凝膠

先配置30%丙烯酰胺凝膠，取丙烯酰胺29g，甲叉雙丙烯酰胺1g，定容至100mL。再用1

倍電泳緩沖液將30%丙烯酰胺凝膠稀釋至8%。

A.510%過硫酸銨

0.1g過硫酸銨溶于1mL超純水中?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

A.6染色液

1g硝酸銀，定容至500mL。

A.7顯影液

500mL蒸餾水中加入10g氫氧化鈉和2mL甲醛。

5

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BB

附錄B

（規(guī)范性附錄）

SSR引物

SSR01F5-ATCCCAAAAGGCAAAATC-3

SSR01R5-CCCTTCCACATTCAGTCA-3

SSR02F5-TGATCAGCGGACAAATCT-3

SSR02R5-GGTGACACTGACCCCATA-3

SSR03F5-TCTGGGAATTTTGGAACTGC-3

SSR03R5-TCCAGTTTTGATCATCTCCAAC-3

SSR04F5-ATTGTGATAGCAACCCCTGG-3

SSR04R5-CACAGATGAGGGCACAAATG-3

SSR05F5-ACGCCAAGAAAATCATCTCC-3

SSR05R5-CCATTGCTGAAGAAAATGGG-3

SSR06F5-GACAGTCTTTCAAGAACTAGAGAGAG-3

SSR06R5-TGGAGCAAACACAGCAGAAC-3

SSR07F5-TGACAGCTACCGAAAATGA-3

SSR07R5-CCTCTAATGCTGACGTGAA-3

SSR08F5-TTTGGACCCTTTCCCTAC-3

SSR08R5-GGATCAAGTAGGCGTTGA-3

SSR09F5-CACCATGTAGCATCTGGG-3

SSR09R5-GATGGATGGATCGACAGA-3

SSR10F5-TTTTGATCCCTCGATAAGTCTTT-3

SSR10R5-TCACACCAGACTCAGCCAATTTA-3

SSR11F5-GACGCCGAGGACTATGAT-3

SSR11R5-GCCTCCACCTTTCCACTA-3

SSR12F5-GTCCCAACTAAACAATCCA-3

SSR12R5-CAAACACCAGCAACCATA-3

SSR13F5-CTACGAAGTCCCAACTAAAC-3

SSR13R5-CAAACACCAGCAACCATA-3

SSR14F5-CCATCTGCGACGACAACG-3

SSR14R5-CCAATGCTCCTCCCTCCA-3

SSR15F5-TCAATTTTCTCCGCTACA-3

SSR15R5-GAGGGATAGTTCAGGTTTG-3

SSR16F5-CCATAACCTCCTCCACTT-3

SSR16R5-GACTTGCTATCCTCCCAC-3

SSR17F5-AGGAGCCGATTATTGAGG-3

SSR17F5-TGGGTTCTACGCCAGTTT-3

SSR18F5-TGGACCTAAGTTTGGGTGGAT-3

SSR18R5-TGCTGCCGCTTGGGTATT-3

SSR19F5-GCCGGTATGTCGTCTTCG-3

SSR19F5-GATCGTTCCAGCGTCAGG-3

SSR20F5-GCTTGGCCGAAAGTGAAA-3

SSR20R5-GAATCCCATCCCGTCTCC-3

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前言