潏河水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測定

微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告2010年12月29日潏河水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測定——潏河水質(zhì)檢測1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮砟康模?．1學(xué)習(xí)并掌握水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的檢測方法。1．2了解國家水質(zhì)評價(jià)的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，學(xué)會(huì)水質(zhì)檢測的方法。原理：水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)是水體是否符合國家水質(zhì)健康標(biāo)準(zhǔn)常用的兩個(gè)測定項(xiàng)目。細(xì)菌總數(shù)是指1ml水樣在普通瓊脂培養(yǎng)基中，37℃經(jīng)24h培養(yǎng)后，所生長的菌落數(shù)（我國規(guī)定自來水1ml細(xì)菌總數(shù)不得超過100個(gè)）。大腸菌群，是以E.coli為代表的，能在37℃、24h~48h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的好氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌的總稱。主要由腸桿菌科中四個(gè)屬內(nèi)的細(xì)菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。這類菌是溫血?jiǎng)游锬c道中的正常菌群，常隨動(dòng)物的糞便污染水源。它們與水中存在的腸道病原菌成正相關(guān)性，而病原菌在水中濃度很低，測定手續(xù)繁瑣，因此，大腸菌群是一個(gè)合適的指示菌，能指示出病原菌存在在于水中的可能性大?。?測定水中大腸菌群有多種方法，其中多管發(fā)酵法較為常用，測定步驟如下：1）初發(fā)酵試驗(yàn)：采用乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，內(nèi)倒置一德漢氏小套管。大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣，37℃培養(yǎng)，2）平板分離：采用伊紅美蘭瓊脂平板（EMB培養(yǎng)基），劃線接種，37℃培養(yǎng)，分離出帶核心的、有金屬光澤的、深紫色、紫色或淡紫色的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢，G-無芽孢桿菌者進(jìn)入復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)3）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：以上陽性菌落（發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣；G-無芽孢桿菌），進(jìn)入復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，原理與初發(fā)酵試驗(yàn)同。經(jīng)24h培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的，最終確定為大腸菌群陽性結(jié)果。以峪河水為研究對象，通過平板菌落計(jì)數(shù)測定水中細(xì)菌總數(shù)，同時(shí)利用多管發(fā)酵法測定總大腸菌群，統(tǒng)計(jì)查表檢測此處水是否符合細(xì)菌學(xué)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。2、實(shí)驗(yàn)材料2．1器材類普通光學(xué)顯微鏡、酒精燈、200-1000μl微量移液器、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、高壓滅菌鍋、微量移液器、試管、吸耳球、載玻片、量筒、錐形瓶、德漢氏小管、接種環(huán)、試管架、移液管、帶玻璃塞空瓶、培養(yǎng)皿等2．2試劑類配制培養(yǎng)基所需原料：乳糖、蛋白胨、牛肉膏、2％伊紅溶液、0.5％美蘭溶液、NaCl、瓊脂和溴甲酚紫乙醇溶液革蘭氏染色：革蘭氏染液（草酸銨結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95﹪乙醇、番紅復(fù)染液）、溴甲酚紫、3.實(shí)驗(yàn)過程3.1.樣品采集和處理取峪河河中央的水樣，取樣方法為：將滅菌帶玻璃塞的空瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，拔開瓶塞，水流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。用報(bào)紙將瓶身及瓶塞擦干凈，然后重復(fù)上步驟取樣。在河的上、中下游分別取水樣，并標(biāo)記為1、2、3號。取回的水樣暫時(shí)放在冰箱中保存。3.2.培養(yǎng)基配制（1）牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基配方：牛肉膏0.6g；蛋白胨2.0g；NaCl1.0g；瓊脂3.5g；蒸餾水200ml。將以上成分加熱溶解于200ml蒸餾水中，調(diào)pH至7.0~7.2（2）乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配制：蛋白胨2.5g；牛肉膏0.75g；乳糖1.25g；NaCl1.25g；1.6%溴甲酚紫乙醇溶液將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及NaCl加熱溶解于250ml蒸餾水中，調(diào)pH至7.2~7.4。加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.25ml，充分混勻，分裝于有小倒管的試管中。（3）伊紅美蘭固體培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）蛋白胨2.5g；NaCl1.25g；蒸餾水250ml；20％乳糖溶液5ml；2％伊紅水溶液5ml；0.5％美蘭水溶液2.5ml按上述量將蛋白胨及NaCl按加熱溶解于250ml蒸餾水中，調(diào)pH至7.6，冷卻至60℃左右時(shí)，再把乳糖溶液、伊紅水溶液及美蘭水溶液按上述量加入。搖勻后，立即倒平板。乳糖在高溫滅菌易被破壞必須嚴(yán)格控制滅菌溫度，115℃33.3.實(shí)驗(yàn)流程（1）水中細(xì)菌總數(shù)的測定（用水樣1測定）1）稀釋水樣：取3個(gè)滅菌試管，編號1、2和3，分別加入9ml滅菌水。取1ml水樣注入1號管內(nèi)，搖勻，再自1號管取1ml加入2號管內(nèi)，如此稀釋到第三管，稀釋度分別為：10-1、10-2和10-3。2）自三個(gè)試管中各取1ml稀釋水樣，加入滅菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做3個(gè)培養(yǎng)皿。3）各傾注15ml已融化并冷卻至45℃4）培養(yǎng)基凝固后，37℃5）計(jì)數(shù)得出該水樣中的細(xì)菌總數(shù)。（2）.多管發(fā)酵法檢測水中總大腸菌群（共三個(gè)水樣）1）水樣稀釋：取兩個(gè)滅菌試管，標(biāo)號1、2、3，分別加入9ml無菌水。用移液管取1ml原水樣加入1號管中，搖勻。再從1號管中取1ml加入2號管中，如此稀釋到第三管，稀釋度分別為：10-1、10-2和10-3。2）初發(fā)酵試驗(yàn)表2污水樣（ml）培養(yǎng)基（ml）1（10-3）5（普通濃度乳糖蛋白胨發(fā)酵試管）1（10-2）5（同上）1（10-1）5（同上）1（原樣）5（同上）用注射器將乳糖蛋白胨培養(yǎng)基灌滿德漢氏小套管倒置放入發(fā)酵管中，115℃滅菌30min，再按表2加水樣。后放在373）平板分離和革蘭氏染色：將24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的和48內(nèi)后產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管，分別劃線接種于伊紅美蘭瓊脂平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)24h，刮取深紫黑色、有金屬光澤或紫黑色、不帶或略帶金屬光澤或淡紫色、中心顏色深的菌落的一小部分進(jìn)行涂片-革蘭氏染色-鏡檢。鏡檢結(jié)果革蘭氏陰性、且無芽胞桿菌,4）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：挑取革蘭氏陰性且無芽孢桿菌菌落另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，37℃根據(jù)確證的初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽性管數(shù)目查表，得到每升水樣中大腸菌群的數(shù)目。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果4．1細(xì)菌總數(shù)的測定結(jié)果表3細(xì)菌總數(shù)的測定稀釋度10-110-210-3重復(fù)測定重復(fù)重復(fù)測定123123123菌落數(shù)97000120000140000980089009200163016001200平均菌落數(shù)11900093001480細(xì)菌總數(shù)120004.2大腸菌群數(shù)測定結(jié)果*表4大腸菌群數(shù)測定結(jié)果*實(shí)驗(yàn)步驟現(xiàn)象重復(fù)水樣接種量（ml）1（原液）1（10-1）1（10-2）1（10-3）初發(fā)酵試驗(yàn)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣1++++2++--3++--48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣12--3--平板分離鑒定G染色及芽孢1++++2-+3++復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣1++++2+3++*：+表示陽性；－表示陰性。表5各水樣發(fā)酵結(jié)果稀釋度1（原樣）10-110-210-31號水樣++++2號水樣-+--3號水樣++--根據(jù)各水樣發(fā)酵結(jié)果查表XIII-6總大腸菌群檢數(shù)表得水樣123每升水樣中總大腸菌群>238009402205.分析討論實(shí)驗(yàn)做了兩次，第一次是把水樣以中度污染的程度設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果平板分離時(shí)的陽性菌落太多以至實(shí)驗(yàn)失敗，這次是以嚴(yán)重污染程度設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)；從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出水樣1的大腸菌含量超過了嚴(yán)重污染的指標(biāo)，水樣2和水樣3的大腸菌含量要低很多。造成這顯著的差異的原因：（1）水樣1是在潏河比較下游的河段取得樣，而水樣2、水樣3則是在中上游取得樣（2）從潏河中游到下游的河道周圍遍布村莊，那些生活污水都往河里排，尤其是人畜糞便這種大腸菌含量極高的污染物也大量往河里面排，大腸菌的含量大大增加6.結(jié)論（1）潏河水的大腸菌污染現(xiàn)象