蛋白質(zhì)與核酸的定性與定量實(shí)驗(yàn)方法資料

蛋白質(zhì)與核酸的定性與定量實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握純化蛋白質(zhì)的原理和方法、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)量原理和方法。進(jìn)一步掌握使用雙縮脲法對(duì)蛋白質(zhì)的定性測(cè)定、利用定糖法對(duì)核酸的定性與定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的定性測(cè)定：雙縮脲法，課本P99蛋白質(zhì)的定量測(cè)定：Folin-酚法，實(shí)驗(yàn)P19核酸的定性與定量測(cè)定：定糖法，課本P131、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)量在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽(yáng)極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點(diǎn)的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽(yáng)極移動(dòng)，直至某一pH位點(diǎn)時(shí)失去電荷而停止移動(dòng)，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)（pl）。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動(dòng)，直到它們的等電點(diǎn)上聚焦為止?？梢?jiàn)在該方法中，等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶pH梯度的組成pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由于其不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負(fù)極間引入等電點(diǎn)彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物，在正極端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負(fù)極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開(kāi)始前兩性電解質(zhì)的混合物pH為一均值，即各段介質(zhì)中的pH相等，用pH0表示。電泳開(kāi)始后，混合物中pH最低的分子，帶負(fù)電荷最多，pI1為其等電點(diǎn)，向正極移動(dòng)速度最快，當(dāng)移動(dòng)到正極附近的酸液界面時(shí)，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，這一分子不再向前移動(dòng)而停留在此區(qū)域內(nèi)。由于兩性電解質(zhì)具有一定的緩沖能力，使其周?chē)欢ǖ膮^(qū)域內(nèi)介質(zhì)的pH保持在它的等電點(diǎn)范圍。pH稍高的第二種兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pI2，也移向正極，由于pI2＞pI1，因此定位于第一種兩性電解質(zhì)之后，這樣，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)按各自的等電點(diǎn)依次排列，形成了從正極到負(fù)極等電點(diǎn)遞增，由低到高的線(xiàn)性pH梯度。編輯本段兩性電解質(zhì)載體與支持介質(zhì)理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過(guò)。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個(gè)體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開(kāi)，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。pH梯度制作利用的兩性電解質(zhì)（ampholyte，商品名為ampholine），是脂肪族多胺和多羧類(lèi)的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場(chǎng)作用下，自然形成pH梯度。凝膠可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等蛋白質(zhì)的純化：凝膠層析，實(shí)驗(yàn)課本

DEAE-Cellulose離子交換：氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等大多是兩性物質(zhì)，在水溶液中帶有電荷，由于生物分子自身的性質(zhì)差異，造成了特定的介質(zhì)中所帶的點(diǎn)和種類(lèi)和密度不同，這就是離子交換的理論依據(jù)。離子交換現(xiàn)象可用下面的方程式表示：Resin-SO3H+Na+H+Resin-SO3Na+H+=Resin-SO3H+Na+\陰離子交換反應(yīng)：Resin-N(CH3)3OH+Cl-=n(ch3)3Cl-+OH-二乙基氨基纖維素DEAE/view/9901378102d276a200292e37.html實(shí)驗(yàn)材料試劑雙縮脲試劑實(shí)驗(yàn)P13Folin-酚試劑，實(shí)驗(yàn)P19地衣酚試劑、二苯胺試劑0.02mol/LNH4Ac、0.06mol/LNH4Ac流洗、0.3mol/LNH4Ac、1.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4Ac器材紫外檢測(cè)儀、自動(dòng)部份收集器、記錄儀Manifold聚焦盤(pán)、電極平臺(tái)、樣品杯實(shí)驗(yàn)方法雙縮脲區(qū)分蛋白質(zhì)與核酸蛋白質(zhì)純化1.平衡:0.02mol/LNH4Ac緩沖液平衡離子交換柱，紫外檢測(cè)儀、記錄儀基線(xiàn)穩(wěn)定;2.上樣:取下柱上端套塞，當(dāng)柱上液面與凝膠床面相切，立即將樣品小心而緩慢地加到柱床表面;3.洗滌:樣品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗滌柱壁1次;4.收集γ-球蛋白:將0.02mol/LNH4Ac緩沖液充滿(mǎn)層析柱，與高位恒壓槽連通，開(kāi)啟自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集；5.洗滌其他球蛋白:記錄儀基線(xiàn)恢復(fù)到零后,用0.06mol/LNH4Ac流洗，不用進(jìn)行收集6.收集白蛋白:待記錄儀基線(xiàn)恢復(fù)到零后，用0.3mol/LNH4Ac緩沖液流洗，自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集;7.柱上再生:待記錄儀基線(xiàn)恢復(fù)到零后,用1.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4Ac流洗，不用進(jìn)行收集;8.再次平衡:待記錄儀基線(xiàn)恢復(fù)到零后，用0.02mol/LNH4Ac流洗1-2個(gè)柱體積蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定/view/e45875cf05087632311212f5.html/p-36650008.htmlEttanIPGphor3簡(jiǎn)要操作指南

注意：

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使用過(guò)程中，請(qǐng)確保室內(nèi)溫度在20！

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該設(shè)備為高壓設(shè)備，任何不當(dāng)操作都可能會(huì)造成受傷或死亡！

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該設(shè)備為雙向電泳系統(tǒng)中的一個(gè)設(shè)備，請(qǐng)閱讀雙向電泳原理和方法手冊(cè)了解其他信息！

1．

水化：

⑴

參照水化液用量表，將水化液或適量樣品(若水化上樣)混合；調(diào)節(jié)泡漲盤(pán)水平，液體小心加入泡漲盤(pán)。

⑵膠條室溫平衡30min，從酸性端（尖端）一側(cè)剝?nèi)PG膠條的保護(hù)膜。膠面朝下，先將IPG膠條尖端(陽(yáng)性端)放入聚焦盤(pán)中，慢慢放下膠條，并前后拖動(dòng)，避免生成氣泡。

⑶從兩端向中間加入約3ml覆蓋油防止水分蒸發(fā)。蓋上泡漲盤(pán)上蓋，室溫水化至少10小時(shí)。

2．

將Manifold聚焦盤(pán)放置在EttanIPGphor3的電極平臺(tái)上，T形口對(duì)齊。

3．

將已水化的IPG膠條轉(zhuǎn)移到任一聚焦盤(pán)膠條槽內(nèi)。膠面朝上，酸端放+極，堿端放－極，并確保膠條位于膠條槽的中央(聚焦盤(pán)膠條槽內(nèi)四對(duì)凸起可用于指導(dǎo)膠條放置在居中位置)。

4．

在每根IPG膠條表面覆蓋6-8mlImmobilineDryStrip覆蓋油，膠條附近的空膠條槽內(nèi)也要加覆蓋油。

5．

取兩個(gè)IEF電極片，用去離子水浸濕后放在濾紙上，去除多余的水。

6．

分別將兩個(gè)IEF電極片放在IPG膠條膠的兩端，將電極壓在兩個(gè)電極片的外緣，并關(guān)閉鎖扣。

7．

樣品杯（若杯上樣）可放在兩個(gè)電極間除聚焦盤(pán)內(nèi)側(cè)凸起外任何位置（切忌放在凸起上），對(duì)于堿性分離范圍的IPG膠條，盡量將樣品杯靠近陽(yáng)極放置。

8．

在樣品杯中加入少量不含樣品的水化液或者覆蓋油檢查是否漏液。上樣前吸走水化液。

9．

上樣前將樣品離心去掉不溶物，每個(gè)樣品杯可加樣20-100μl，濃度不超過(guò)10mg/ml，加覆蓋油覆蓋樣品。

10．

蓋上安全蓋，開(kāi)啟電源，開(kāi)關(guān)在儀器背面右側(cè)。開(kāi)機(jī)后，系統(tǒng)經(jīng)過(guò)自檢后進(jìn)入待機(jī)狀態(tài)。

11．

若需打開(kāi)安全蓋，只需按下安全蓋即可解鎖，同時(shí)運(yùn)行暫停，只有重新合上安全蓋后程序才會(huì)繼續(xù)運(yùn)行。

12．

程序設(shè)置和選擇：可通過(guò)安裝在PC上的控制軟件或在EttanIPGphor3面板上按鍵設(shè)置程序，在EttanIPGphor3上可以?xún)?chǔ)存10個(gè)多達(dá)9步設(shè)置好的程序；這些設(shè)置好的程序可以直接調(diào)用，也可以在編輯后運(yùn)行。可以設(shè)置的參數(shù)包括水化溫度和時(shí)間，等電聚焦時(shí)的最大電流，電壓，溫度及電壓改變模式等。請(qǐng)參見(jiàn)雙向電泳原理和方法手冊(cè)了解不同長(zhǎng)度和pH范圍膠條的推薦運(yùn)行條件。

13．

用左、右箭頭將光移至Prot#1處，用上、下箭頭選擇合適的方法號(hào)。使用右向箭頭移動(dòng)光標(biāo)至File，并用上、下箭頭編輯方法名。

14．

如果需要，設(shè)定溶脹時(shí)間、溫度和等電聚焦的溫度20度、最大電流50uA/strip和膠條數(shù)等。

15．

按EDIT鍵進(jìn)入IEF參數(shù)設(shè)置：用左、右箭頭將光移至需編輯參數(shù)處，用上、下箭頭改變參數(shù)。最多可以設(shè)定九步程序的電壓、持續(xù)時(shí)間及電壓改變模式。

16．

再按一次EDIT鍵保存所有修改。按START開(kāi)始，輸入膠條數(shù)，再次按下START開(kāi)始運(yùn)行程序。

在運(yùn)行過(guò)程中，按STOP鍵暫停程序；再按START鍵則繼續(xù)運(yùn)行；連續(xù)按二次STOP鍵則結(jié)束程序，并顯示總的運(yùn)行時(shí)間，伏小時(shí)數(shù)等參數(shù)。

17．

待程序運(yùn)行結(jié)束，關(guān)閉電源；取出膠條進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。清潔聚焦平臺(tái)后蓋好安全蓋。

蛋白質(zhì)定量測(cè)定區(qū)分DNA\RNA核酸的定量測(cè)定注意事項(xiàng)1、蛋白質(zhì)的純化：1．不同的蛋白質(zhì)，具有不同的等電點(diǎn)。在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)根據(jù)分離要求，除去目的產(chǎn)物之外的雜蛋白；若目的產(chǎn)物也是蛋白質(zhì)，且等電點(diǎn)較高時(shí)，可先除去低于等電點(diǎn)的雜蛋白，如細(xì)胞色素C的等電點(diǎn)為10．7，在細(xì)胞色素C的提取純化過(guò)程中，調(diào)pH＝6．0除去酸性蛋白，調(diào)pH＝7．5～8．0，除去堿性蛋白。2．同一種蛋白質(zhì)在不同條件下，等電點(diǎn)不同。在鹽溶液中，蛋白質(zhì)若結(jié)合較多的陽(yáng)離子，則等電點(diǎn)的pH值升高；因?yàn)榻Y(jié)合陽(yáng)離子后，正電荷相對(duì)增多，只有pH值升高才能達(dá)到等電點(diǎn)狀態(tài)，如胰島素在水溶液中的等電點(diǎn)為5．3，在含一定濃鋅鹽的水—丙酮溶液中的等電點(diǎn)為6；如果改變鋅鹽的濃度，等電點(diǎn)也會(huì)改變。蛋白質(zhì)若結(jié)合較多的陰離子(如C1-、SO42-等)，則等電點(diǎn)移向較低的pH值，因?yàn)樨?fù)電荷相對(duì)增多了，只有降低pH值才能達(dá)到等電點(diǎn)狀態(tài)。3．目的藥物成分對(duì)pH值的要求。生產(chǎn)中應(yīng)盡可能避免直接用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿調(diào)節(jié)pH值，以免局部過(guò)酸或過(guò)堿，而引起目的藥物成分蛋白或酶的變性。另外，調(diào)節(jié)pH值所用的酸或堿應(yīng)與原溶液中的鹽或即將加入的鹽相適應(yīng)，如溶液中含硫酸銨時(shí)，可用硫酸或氨水調(diào)pH值，如原溶液中含有氯化鈉時(shí)，可用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)pH值?？傊?，應(yīng)以盡量不增加新物質(zhì)為原則。4．由于各種蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，仍存在一定的溶解度，使沉淀不完全，而多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)又都十分接近，因此當(dāng)單獨(dú)使用等點(diǎn)電沉淀