紅毛丹ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

紅毛丹ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選林興娥1*，?？『?，周兆禧1，馬蔚紅1，肖正新3，尹俊梅2?基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20153062）。作者簡(jiǎn)介：林興娥（1981-），女，碩士，助理研究員，主要從事熱帶果樹(shù)種質(zhì)資源收集、保存與評(píng)價(jià)等研究，E-mail：linxinge0410@163.com。*通訊作者?；痦?xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20153062）。作者簡(jiǎn)介：林興娥（1981-），女，碩士，助理研究員，主要從事熱帶果樹(shù)種質(zhì)資源收集、保存與評(píng)價(jià)等研究，E-mail：linxinge0410@163.com。*通訊作者。摘要為了建立適宜于紅毛丹基因組DNA的ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，本研究首先采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)體系中的各組分（DNA、引物、Mg2+、dNTPs和TaqDNA聚合酶）進(jìn)行了優(yōu)化比較，確定了最佳的20μL反應(yīng)體系，包括：DNA模板30ng、dNTPs0.10mmol/L、引物0.2μmol/L、TaqDNA聚合酶1.0U、Mg2+2.0mmol/L；進(jìn)一步利用該體系從20條ISSR引物中篩選出9條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物，從3個(gè)紅毛丹品系中共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶204條，多態(tài)條帶比例達(dá)76%。本研究建立的ISSR-PCR體系及篩選的引物，為以后利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行紅毛丹的資源評(píng)價(jià)、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等相關(guān)研究提供了技術(shù)便利。關(guān)鍵詞紅毛丹；ISSR；體系優(yōu)化，引物篩選OptimizationofISSR-PCRSystemandPrimersScreeningforRambutan(NepheliumlappaceumL.)LinXing-e1*,NiuJunhai2,ZhouZhaoxi1,MaWeihong1,XiaoZhengxin3,YinJunmei2（1InstituteofBananaandPlantain,CATAS,Hainan,Haikou,570102;2TropicalCropsGeneticResourcesInstitute,CATAS,Hainan,Danzhou,571737;3BureauofStateFarm,Hainan,Baoting,572300）AbstractInordertoestablishanoptimalreactionsystemofISSR-PCRinrambutan,thesuitableconcentrationrangesofthedifferentinfluentialfactors(DNAtemplate,Mg2+,dNTPs,primerandTaqpolymerase)werescreenedbythesinglefactorexperimentandorthogonaldesignexperimentwithgenomeDNAastemplate.TheoptimalreactionsystemofISSR-PCRinrambutanwere30ngDNA,0.10mmol/LdNTPs,0.2μmol/Lprimer,2.0mmol/LMg2+and1.0UTaqDNApolymerase.Andthen,9primerswerescreenedoutfrom20ISSRprimersbasedontheirstableamplification,clearbandingpatternsandgoodpolymorphism.204polymorphicbandswereamplifiedby9ISSRprimersandaverageproportionofpolymorphiclociwas76%.Inall,boththeoptimizedISSR-PCRreactionsystemandselectedprimerswillfacilitatetheresearchesaboutgermplasmevaluation,varietyidentificationandgeneticmapconstructionbyusingISSRtechnologyinrambutan.KeywordsRambutan(Nephelium

lappaceumL.),ISSR,Optimizationofsystem,Primersscreening紅毛丹（Nephelium

lappaceum）為無(wú)患子科（Sapindaceae）韶子屬（Nephelium）熱帶多年生常綠喬木植物，與荔枝、龍眼同科，屬熱帶珍稀水果，原產(chǎn)于馬來(lái)西亞群島，現(xiàn)廣泛種植于東南亞、澳洲、南美洲和非洲等熱帶地區(qū)[1]。紅毛丹果實(shí)外觀奇特，果肉營(yíng)養(yǎng)豐富，口感清甜，可鮮食和加工制罐頭，此外還可制蜜餞、果醬和釀酒等，果殼和種仁含抗氧化和抗菌活性成分，具有極高的食用和藥用價(jià)值[2-4]。我國(guó)于六十年代初從馬來(lái)西亞開(kāi)始引種試種，1995年開(kāi)始大規(guī)模推廣種植，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求量大，但因?qū)囟?、濕度、土壤等生長(zhǎng)條件要求苛刻，目前僅在我國(guó)海南東南部、云南西雙版納和臺(tái)灣屏東等少數(shù)地區(qū)種植。此外，由于生產(chǎn)中栽培管理水平低下，部分栽培品系產(chǎn)量和商品性低，新品種匱乏等原因，限制了我國(guó)紅毛丹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，開(kāi)展國(guó)內(nèi)外紅毛丹種質(zhì)資源調(diào)查、收集和評(píng)價(jià)，針對(duì)性地開(kāi)展本土化育種，是實(shí)現(xiàn)紅毛丹產(chǎn)業(yè)規(guī)?；沙掷m(xù)發(fā)展的有效途徑。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紅毛丹種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)研究報(bào)道非常有限，且以株型、葉型、果型等農(nóng)藝學(xué)性狀和果實(shí)品質(zhì)性狀等為主，并以此評(píng)判不同類型之間的親緣關(guān)系[5-8]。由于形態(tài)學(xué)標(biāo)記存在受環(huán)境影響大、周期長(zhǎng)、靈敏度低等問(wèn)題，且經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的引種交流和無(wú)性繁殖，導(dǎo)致生產(chǎn)中同種異名和同名異種現(xiàn)象十分普遍，因此，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記已不能滿足品種鑒定和親緣關(guān)系分析的要求?；赑CR原理的分子標(biāo)記技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的方法具有不受環(huán)境影響、多態(tài)性高、數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，是評(píng)價(jià)種質(zhì)資源多樣性更準(zhǔn)確有效的手段。2002年chew[9]等利用RAPD標(biāo)記對(duì)馬來(lái)西亞農(nóng)業(yè)發(fā)展研究院(MARDI)保存的211份紅毛丹種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性檢測(cè)，結(jié)果表明不同種質(zhì)遺傳相似性系數(shù)范圍為0.492~0.963，同時(shí)采用同工酶分析技術(shù)分析紅毛丹種質(zhì)資源遺傳多樣性；2005年Chew[10]等再次利用RAPD標(biāo)記對(duì)MARDI保存的紅毛丹種質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同種質(zhì)遺傳相似性系數(shù)范圍為0.232~0.900，平均0.444；Clyde[11]等比較了RAPD和ISSR兩種分子標(biāo)記檢測(cè)紅毛丹種質(zhì)資源遺傳多樣性水平，結(jié)果表明RAPD標(biāo)記檢測(cè)到的多態(tài)性水平更高，更適合用于紅毛丹種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。DeAndrade等[12]采用熒光素標(biāo)記的選擇性擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（fluorescentamplifiedfragmentlengthpolymorphism,fAFLP）對(duì)巴西圣保羅地區(qū)果園收集保存的18個(gè)實(shí)生苗品系進(jìn)行檢測(cè)，顯示不同品系之間存在遺傳差異，和表型及生化分析結(jié)果一致，表明種子不適合用于商業(yè)化種苗繁殖；Sakuanrungsirikul等[13]采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)泰國(guó)的紅毛丹栽培品種進(jìn)行了遺傳多樣性評(píng)價(jià)。我國(guó)引種紅毛丹的歷史已經(jīng)超過(guò)50年，目前國(guó)內(nèi)紅毛丹研究主要集中在栽培技術(shù)、病蟲(chóng)害防治、采后保鮮、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、營(yíng)養(yǎng)和藥用成分分析鑒定等少數(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，針對(duì)主要性狀的遺傳規(guī)律、分子機(jī)制等尚無(wú)研究，缺乏系統(tǒng)性的資源鑒定評(píng)價(jià)及育種基礎(chǔ)研究。因此，借助分子標(biāo)記技術(shù)，分析我國(guó)現(xiàn)有紅毛丹種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為品種分類、鑒定及雜交育種改良應(yīng)用提供理論依據(jù)。簡(jiǎn)單序列重復(fù)間序列（Intersimplesequencerepeats,ISSR）是一種利用PCR技術(shù)擴(kuò)增重復(fù)序列相同但方向相反的相鄰二段簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)域，以檢測(cè)核苷酸序列多態(tài)性的方法。與RAPD、RFLP、AFLP、SSR相比，該方法具有多態(tài)性高、穩(wěn)定、成本低、易操作等優(yōu)勢(shì)，目前已在荔枝[14]、龍眼[15]、芒果[16]、香蕉[17]、桃[18]、石榴[19]、杏[20]等重要果樹(shù)作物上廣泛應(yīng)用。但物種不同，ISSR-PCR反應(yīng)條件也不同，同時(shí)對(duì)于循環(huán)擴(kuò)增退火溫度的要求嚴(yán)格，因此，有必要對(duì)ISSR反應(yīng)體系中各組分（DNA模板量、引物濃度、Mg2+、dNTPs和TaqDNA聚合酶）和引物退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。本研究擬通過(guò)單因素分析和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，對(duì)ISSR反應(yīng)體系中各組分(DNA模板量、引物濃度、Mg2+、dNTPs和TaqDNA聚合酶)進(jìn)行優(yōu)化，以期建立適合于紅毛丹基因組ISSR-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系，并利用優(yōu)化后的ISSR-PCR體系進(jìn)行引物篩選，旨在為今后開(kāi)展紅毛丹種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)、指紋圖譜構(gòu)建、遺傳育種改良等研究提供技術(shù)支持。1材料與方法1.1材料試驗(yàn)所用紅毛丹材料均來(lái)自保亭熱帶作物研究所紅毛丹種質(zhì)資源圃，編號(hào)23為優(yōu)化所用品系，栽培品系保研2號(hào)、保研5號(hào)和編號(hào)60為多態(tài)性引物篩選品系，采取枝條上無(wú)病蟲(chóng)害的葉片，-80℃保存?zhèn)溆谩?.2試劑DNA提取試劑CTAB、Tris購(gòu)自Amresco，瓊脂糖購(gòu)自Spanish，EDTA、PVP40000、Tris平衡酚、GV核酸染料購(gòu)自solarbio，10×buffer、dNTP（10mM）、rTaq酶（5U/μL）、Mg2+（25mM）購(gòu)自寶生物工程有限公司；ISSR分子標(biāo)記引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。表1.紅毛丹ISSR-PCR體系優(yōu)化所用引物序列引物Primer引物序列（5’-3’）Primers(5’-3’)引物Primer引物序列（5’-3’）Primers(5’-3’)ISSR1CTCTCTCTCTCTCTCTRGISSR11CAAGAGAGAGAGAISSR2CTCTCTCTCTCTCTCTTGISSR12GGGCGAGAGAGAGAGAGAGAISSR3CTCTCTCTCTCTCTCTRAISSR13GAGGAGGAGGAGRCISSR4CTCTCTCTCTCTCTCTRCISSR14GAGAGAGAGAGAGARGISSR5CACACACACACARYISSR15GTGGTGGTGGTGRCISSR6CACACACACACARGISSR16CTCCTCCTCCTCRCISSR7GTGTGTGTGTGTYRISSR17CACCACCACCACRCISSR8GTGTGTGTGTGTAYISSR18GTGTGTGTGTGTGTYGISSR9AGAGAGAGAGAGAGYCISSR19CACACACACACACAYCISSR10GTGTGTGTGTGTRGISSR20CACACACACACACAYG注：R=(A,G);Y=(C,T).1.3紅毛丹總DNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)采用改良2×CTAB法[21]提取紅毛丹葉片基因組DNA，用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)樣品DNA質(zhì)量及完整性，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，將總DNA稀釋至20ng/μL后，-20℃保存待用。1.4ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化采用引物ISSR1對(duì)紅毛丹ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。參照荔枝、龍眼等[22-23]的ISSR-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，原初反應(yīng)體系定為20μL，內(nèi)含2μL10×Buffer、50ngDNA、2.0mmol/LMg2+、0.2mmol/LdNTPs、0.3μmol/L引物、1.0UTaqDNA聚合酶，滅菌ddH2O補(bǔ)足至20μL。先采用單因素隨機(jī)實(shí)驗(yàn)對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系中的Mg2+、引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA濃度進(jìn)行5水平單因素隨機(jī)實(shí)驗(yàn)，3次重復(fù)。再采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系中的Mg2+、引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA濃度進(jìn)行5因素4水平16個(gè)組合的篩選分析，3次重復(fù)，設(shè)計(jì)方案如表2和表3。表2ISSR-PCR擴(kuò)增影響因子的梯度實(shí)驗(yàn)水平LevelDNA(ng)DNTPs(mmol/L)Primer(μmol/L)Mg2+(mmol/L)TaqDNApolymerase(U)10.2520.503300.754401.005500.300.53.01.256600.307700.400.74.01.758800.40表3ISSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表處理組合Combinations因素FactorDNA(ng)DNTPs(mmol/L)Primer(μmol/L)Mg2+(mmol/L)TaqDNApolymerase(U)10.2520.503100.200.302.00.754100.250.402.51.005200.150.301.01.006200.100.401.50.7570.5080.259300.200.401.00.5010300.250.301.50.2511301.0012300.7513400.7514401.0015400.150.402.00.2516400.100.302.50.501.5退火溫度的確定ISSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，52℃復(fù)性1min，72℃延伸1.5min，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，經(jīng)GoldView染色后在Tanon-4100凝膠成像分析系統(tǒng)上采集圖像，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)每條引物的理論退火溫度，每間隔2℃共設(shè)置6個(gè)退火溫度梯度，采用上述擴(kuò)增程序進(jìn)行退火溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，根據(jù)ISSR-PCR產(chǎn)物結(jié)果分析，確定每條引物的最佳退火溫度。1.6反應(yīng)體系穩(wěn)定性的檢測(cè)及引物篩選利用優(yōu)化的紅毛丹ISSR反應(yīng)體系，在3份果皮顏色差異大的紅毛丹材料對(duì)20條ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，以篩選出多態(tài)性好、擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定的引物。2結(jié)果與分析2.1紅毛丹基因組DNA提取采用2×CTAB法提取紅毛丹基因組DNA，取6μL紅毛丹DNA樣品，加入2μL6×DNALoadingBuffer用1.0%的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，各個(gè)樣品DNA主條帶清晰，無(wú)降解，無(wú)RNA污染，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖1紅毛丹基因組DNA注：M：Marker32.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了8個(gè)DNA模板濃度梯度，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，隨著DNA模板量的增加，擴(kuò)增條帶亮度增加，但條帶數(shù)少，當(dāng)DNA模板濃度為10~20ng/μL時(shí)，擴(kuò)增條帶多，說(shuō)明DNA模板濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響較大，DNA模板濃度為10ng/μL時(shí)條帶更清晰，因此確定DNA模板最適宜濃度為10ng/μL。圖2模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響注：M：Marker3；1~8：DNA模板濃度依次為10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng2.2.2dNTPs濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響由圖3可知，在0.10~0.45mmol/LdNTPs濃度范圍內(nèi)，PCR擴(kuò)增效果差異不顯著，條帶清晰，沒(méi)有彌散，說(shuō)明dNTPs濃度對(duì)紅毛丹ISSR-PCR反應(yīng)影響較小，因此，從節(jié)約成本的角度考慮，確定0.1mmol/L為適宜的dNTPs濃度。圖3dNTPs濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響注：M：Marker3；1~8：dNTPs濃度依次為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.50mmol/L2.2.3Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響由圖4可知，隨著Mg2+濃度的增加，PCR擴(kuò)增條帶逐漸彌散，Mg2+濃度為1.5mmol/L和2.5mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶亮且清晰，因此，確定1.5mmol/L為最適宜Mg2+濃度。圖4Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響注：M：Marker3；1~8：Mg2+濃度依次為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mmol/L2.2.4引物濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響由圖5可知，隨著引物濃度的增加，PCR擴(kuò)增條帶逐漸彌散，且有部分條帶缺失，當(dāng)引物濃度為0.2μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶多，條帶清晰度較好。因此，確定0.2μmol/L為最佳引物濃度。圖5引物濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響注：M：Marker3；1~8：引物濃度依次為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80mmol/L2.2.5TaqDNA聚合酶濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響由圖6可知，當(dāng)TaqDNA聚合酶濃度為0.25~0.75U時(shí)，PCR擴(kuò)增條帶弱，且有部分條帶缺失，擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定，當(dāng)TaqDNA聚合酶濃度為1.00U時(shí)，條帶亮度高且清晰，條帶數(shù)量多，隨著TaqDNA聚合酶濃度的增加，PCR擴(kuò)增條帶亮度逐漸減弱。因此，確定1.00U為最佳TaqDNA聚合酶濃度。圖6TaqDNA聚合酶濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響注：M：DNAMarker3；1~8：TaqDNA聚合酶濃度依次為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00U綜合各因素考慮，最終確定ISSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為10ng/μLDNA，1.5mmol/LMg2+，0.1mmol/LdNTPs，0.4μmol/Lprimer，1.0UTaqDNA聚合酶，滅菌ddH2O補(bǔ)足至20μL。2.3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(45)對(duì)紅毛丹ISSR-PCR反應(yīng)體系的5個(gè)因素（模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和Taq聚合酶濃度）在4個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，選取ISSR1作為擴(kuò)增引物，每個(gè)處理3次重復(fù)，正交設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖7。除組合11和組合16外，其他各組合擴(kuò)增條帶缺失嚴(yán)重，且條帶不清晰，與組合11相比，組合16擴(kuò)增條帶少，豐富度不夠。因此，確定組合11為最優(yōu)ISSR-PCR反應(yīng)體系，其擴(kuò)增條帶豐富，清晰度較高且特異性條帶和非特異性條帶差異明顯。因此，正交實(shí)驗(yàn)得出的紅毛丹ISSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為30ng/μLDNA，2.0mmol/LMg2+，0.1mmol/LdNTPs，0.2μmol/Lprimer，1.0UTaqDNA聚合酶，滅菌ddH2O補(bǔ)足至20μL。圖7正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(45)得到的各處理擴(kuò)增結(jié)果M：DNAMarker3；編號(hào)1~16分別對(duì)應(yīng)表3中各處理組合，每個(gè)處理3次重復(fù)。2.5退火溫度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響每條引物的實(shí)際退火溫度和理論退火溫度不一致，退火溫度是影響擴(kuò)增條帶清晰度的重要因素之一，實(shí)驗(yàn)對(duì)20條ISSR引物分別進(jìn)行了退火溫度優(yōu)化，表4為部分引物的最佳退火溫度。以引物ISSR16為例，理論退火溫度54.4℃，設(shè)定4個(gè)溫度梯度（50℃、52℃、54℃、56℃）對(duì)其進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖8所示，引物ISSR16在退火溫度為50℃時(shí)，擴(kuò)增的主條帶清晰且明亮，隨著退火溫度的升高，擴(kuò)增條帶亮度減弱，出現(xiàn)非特異性條帶，當(dāng)退火溫度達(dá)到56℃時(shí)，擴(kuò)增主條帶模糊不清。因此，引物ISSR16在紅毛丹ISSR-PCR反應(yīng)中的最適退火溫度為50℃。圖8不同退火溫度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響注：1~4：引物ISSR16的退火溫度依次是50℃、52℃、54℃、56℃Fig.8EffectofannealingtemperatureonISSR-PCRNote:1-4:annealingtemperaturewere50℃、52℃、54℃、56℃表4引物篩選結(jié)果引物理論Tm(℃)優(yōu)化Tm(℃)擴(kuò)增條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)多態(tài)位點(diǎn)百分比(%)ISSR156.254.037310.84ISSR255.050.033220.67ISSR456.250.032210.66ISSR547.154.025210.84ISSR648.554.024200.83ISSR747.150.019160.84ISSR952.850.041350.85ISSR1354.450.034260.76ISSR1654.450.023120.52合計(jì)2682040.762.6ISSR引物篩選利用優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)20條ISSR引物進(jìn)行篩選，最后選擇出條帶清晰且多態(tài)性高的引物9條（表4），9條引物總擴(kuò)增條帶數(shù)為268條，其中多態(tài)性條帶數(shù)為204條，多態(tài)性比例達(dá)76%，表現(xiàn)出了較為豐富的多態(tài)性，同時(shí)也驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得的ISSR-PCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的。圖9為引物ISSR2對(duì)24份紅毛丹種質(zhì)材料擴(kuò)增結(jié)果，24份材料擴(kuò)增條帶清晰，條帶豐富，多態(tài)性高，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)確立的ISSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系適用于紅毛丹種質(zhì)資源ISSR遺傳多樣性分析。圖9引物ISSR2對(duì)24份紅毛丹品系DNA的ISSR擴(kuò)增帶型3討論ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是基于PCR反應(yīng)的技術(shù)，物種不同，其反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序亦不同，因此，需要對(duì)不同的物種及實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而保證標(biāo)記分析在后續(xù)研究中的穩(wěn)定性和可靠性。本研究首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)各PCR影響因素進(jìn)行單因素多水平的研究，明確ISSR-PCR反應(yīng)的主要影響因子，確定各因子的最佳用量，但由于單因素實(shí)驗(yàn)不能兼顧各因素間的交互作用，因此再通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)體系進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，從而確定適合紅毛丹ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系。由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：DNA模板濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)影響較大，DNA模板的純度和完整性是影響PCR的重要因素，DNA模板過(guò)多在退火時(shí)會(huì)造成模板和引物競(jìng)爭(zhēng)，降低特異性擴(kuò)增效率，導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加，電泳條帶彌散。實(shí)驗(yàn)確定的最佳DNA模板為10ng/μL，這與杏、葡萄等研究結(jié)果一致。單因素實(shí)驗(yàn)中dNTPs濃度在0.10~0.45mmol/L范圍內(nèi)擴(kuò)增結(jié)果差異不明顯，說(shuō)明dNTPs濃度對(duì)紅毛丹ISSR-PCR反應(yīng)影響較小，單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，dNTPs最佳濃度為0.1mmol/L。Mg2+濃度主要影響酶活性，Mg2+濃度過(guò)低會(huì)顯著降低TaqDNA聚合酶的活性，使PCR產(chǎn)物減少，Mg2+濃度過(guò)高會(huì)降低反應(yīng)的特異性，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度，單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳引物濃度為0.2μmol/L，這與龍眼的研究結(jié)果一致。TaqDNA聚合酶濃度高會(huì)增加非特異性產(chǎn)物，濃度過(guò)低會(huì)減少PCR產(chǎn)物，單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳TaqDNA聚合酶濃度為1.0U。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到紅毛丹ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系為：DNA模板30ng、dNTPs0.10mmol/L、引物0.2μmol/L、TaqDNA聚合酶1.00U、Mg2+2.0mmol/L，總體積20μL，并利用該體系從20條ISSR引物中篩選出9條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的ISSR引物，9條ISSR引物共產(chǎn)生多態(tài)性條帶204條，多態(tài)比例達(dá)76%，說(shuō)明該優(yōu)化體系擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，適用于紅毛丹ISSR-PCR反應(yīng)，為今后紅毛丹從分子水平進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、品種指紋圖譜構(gòu)建等研究奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)[1]ChewPC,Mardaleni,NormahMN,etal.Activatedcharcoaliscrucialforsuccessfulmicropropagationoframbutan(NepheliumlappaceumLinn.)[J].MalaysianAppliedBiology,2008,37(1):11-20[2]HarahapSN,RamliN,VafaeiN,etal.Physicochemicalandnutritionalcompositionoframbutananaksekolah(NepheliumlappaceumL.)seedandseedoil[J].PakistanJournalofNutrition,2012,11(11):1073-1077[3]PalanisamyU

,ManaharanT,TengLL,etal.Rambutanrindinthemanagementofhyperglycemia[J].FoodResearchInternational,2011,7(44):2278-2282[4]梁文娟,馬青云,蔣合眾,等.紅毛丹果殼的化學(xué)成分研究[J].中草藥,2011,42(7):1271-1275[5]WhiteheadC.Therambutan:adescriptionofthecharacteristicsandpotentialofmoreimportantvarieties[J].MalaysiaAgricultureJournal,1959,42(2):53-75[6]AndradeRAD,LemosEGDM,MartinsABG,etal.Morphologicandchemicalcharacterizationoframbutanfruits[J],RevistaBrasileiradeFruticultura,2008,30(4):958-963.[7]AndradeRAD,LemosEGDM,MartinsABG,etal.Morphologicalcharacterizationoframbutanplants,ActaScientiarum.Agronomy,2009,31(4):613-619.[8]BarretoLF,DeAndradeRA,BarretoLF,etal.Characterizationoframbutanplantsbyfoliaraspects,AfricanJournalofAgriculturalResearch,2015,10(36):3607-3613.[9]ChewPC,ClydeMM,NormahMN,etal.5DNApolymorphismsinaccessionsofNepheliumlappaceumL.ManagingPlantGeneticDiversity[M].UK:CABIPublishing,2002:57-60.[10]ChewPC,ClydeMM,NormahMN,etal.Geneticdiversityandrelatednessamongaccessionsoframbutan(NepheliumLappaceumL).MalaysianAppliedBiologyJournal,2005,34(1):21-29.[11]ClydeMM,ChewPC,NormahMN,etal.GeneticdiversityofNepheliumramboutan-akeLeenh.AssessedusingRAPDandISSRmark