第三章 突變的應(yīng)用

01第三章突變的應(yīng)用第一節(jié)

誘變育種一、概述二、誘變育種方案的設(shè)計三、誘變育種的一般步驟四、誘變育種中應(yīng)注意的一些問題（一）誘變育種技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展工業(yè)與工程需求：發(fā)酵工業(yè)尤其是抗生素工業(yè)生產(chǎn)菌株選育工作的需要；理論與技術(shù)基礎(chǔ)：Thom和Steinberg（1939）用X射線在真菌中首次誘發(fā)基因突變成功；一、概述問題探索與技術(shù)發(fā)展：Davis對各種誘變篩選程序進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)比較；Calam等對各種誘變劑量下的產(chǎn)量分步曲線進(jìn)行了比較；Dahl等人對篩選工作可能誤差進(jìn)行了分析并提出了設(shè)置出發(fā)菌株對照的必要性；各種自動化和高通量篩選技術(shù)出現(xiàn)。提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量；改善菌種特性，提高產(chǎn)品質(zhì)量，簡化工藝條件；開發(fā)新產(chǎn)品；給代謝調(diào)控育種提供技術(shù)手段（二）誘變育種技術(shù)在育種工作的作用

產(chǎn)量是一種數(shù)量性狀，數(shù)量性狀的特性和基因突變的特點決定了高產(chǎn)菌株的誘變選育一般具有以下一些特點：盲目性大；篩選工作繁瑣，工作量大；工作效率低，周期長；難以集合多個優(yōu)良性狀（三）高產(chǎn)菌株誘變育種的特點制定明確的選育目標(biāo)建立可行的篩選方法確定誘變篩選流程二、誘變育種方案的設(shè)計出發(fā)菌株↓純化、活化、前培養(yǎng)（同步培養(yǎng)）培養(yǎng)液↓離心收集細(xì)胞、洗滌，制備均一的菌懸液（玻璃株打散、過濾）單細(xì)胞或單孢子懸液↓活菌計數(shù)，誘變預(yù)備試驗誘變處理↓活細(xì)胞計數(shù)，致死率計算后培養(yǎng)（中間培養(yǎng)）↓平板分離↓變異率計算初篩→復(fù)篩→保藏及擴(kuò)大試驗三、誘變育種的一般步驟盡量選擇既往誘變史少的高產(chǎn)菌株野生菌株：突變可能性較大;自然選育的生產(chǎn)菌株：適應(yīng)生產(chǎn)環(huán)境，兼具野生特性，也是良好的出發(fā)菌株;誘變改造菌株：負(fù)突變可能性較大，可結(jié)合其它育種方法改變其遺傳保守性（一）出發(fā)菌株的選擇挑選純系（遺傳純）菌株選擇對誘變劑敏感的菌株采用多出發(fā)菌株更換出發(fā)菌株具有特定生產(chǎn)性狀的可能性：要確有特定產(chǎn)物的代謝途徑（一）出發(fā)菌株的選擇單細(xì)胞微生物對數(shù)中后期：生長旺盛，細(xì)胞濃度較高，對誘變劑敏感；同步培養(yǎng)物：誘變劑處理時，群體中變化一致；絲狀微生物產(chǎn)孢子真菌：將其同步培養(yǎng)至孢子剛萌發(fā)的高生理活性狀態(tài)（芽管的長度相當(dāng)于孢子直徑的0.5~1倍）；不產(chǎn)孢子的真菌：采用年幼的菌絲體進(jìn)行誘變處理（對尖端菌絲、單菌落邊緣菌絲或小段菌絲懸浮液進(jìn)行誘變處理）（二）誘變菌株的培養(yǎng)/前培養(yǎng)前培養(yǎng)的培養(yǎng)基：富含核苷酸或堿基，使細(xì)胞內(nèi)具有豐富的內(nèi)源性堿基，DNA被誘變劑作用后所造成的損傷能快速通過復(fù)制而形成突變，可以獲得較高的突變率（二）誘變菌株的培養(yǎng)選擇合適的介質(zhì)使細(xì)胞或孢子要處于良好的分散狀態(tài)調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)募?xì)胞或孢子密度酵母細(xì)胞、霉菌孢子：106~107個/ml；細(xì)菌細(xì)胞、放線菌孢子：108個/ml（三）菌懸液的制備

誘變劑的選擇選擇毒性小、易于防護(hù)、安全性強(qiáng)的誘變劑；選擇操作簡便、便宜易得的誘變劑；選擇不易發(fā)生回復(fù)突變的誘變劑（哪些？）結(jié)合出發(fā)菌株特性結(jié)合細(xì)胞的透性和生理狀態(tài)經(jīng)常變換誘變劑或復(fù)合處理（四）誘變處理

誘變劑量的選擇最適劑量因誘變劑的類型、出發(fā)菌株及其生理狀態(tài)的不同而不同高產(chǎn)菌株在低劑量時效果較好對多核細(xì)胞、孢子、低產(chǎn)菌株劑量不宜過低質(zhì)量性狀宜選用高劑量經(jīng)多次誘變的菌株可用一次強(qiáng)處理來激活一次強(qiáng)誘變后，通常接著進(jìn)行2~3次較低劑量的溫和誘變，以利于菌株遺傳性狀的穩(wěn)定（四）誘變處理

X-射線的照射劑量與亞熱帶鏈霉菌白霉素高產(chǎn)菌株39#變異的關(guān)系形態(tài)突變型

負(fù)突變型

正突變型紫外線照射劑量與龜裂鏈霉菌土霉素高產(chǎn)菌株293#變異的關(guān)系誘變劑量的控制方法化學(xué)誘變劑：濃度、處理時間和處理條件物理誘變劑：照射距離、照射時間和照射功率或輻射強(qiáng)度（四）誘變處理

乙烯亞胺與紫外線復(fù)合誘變處理結(jié)果1-對照；2-乙烯亞胺（濃度1:7000）；3,5,7,9-紫外線；4,6,8,10-乙烯亞胺加紫外線紫外線的劑量（erg/mm2）：3,4-2000；5,6-4000；7,8-6000；9,10-10000處理方式與方法單一誘變劑處理;復(fù)合處理直接處理：在緩沖液或無菌生理鹽水體系中對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，然后涂平板分離突變株；生長過程處理：在搖瓶培養(yǎng)基或固體平板中加入誘變劑，在菌體生長時進(jìn)行誘變處理（適用？）后培養(yǎng)：將誘變處理過的細(xì)胞在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使突變基因穩(wěn)定、純合并表達(dá)（消除表型延遲）。后培養(yǎng)培養(yǎng)基：要求營養(yǎng)豐富（五）后培養(yǎng)

菌株的分離與挑取：多為平板分離，菌落可隨機(jī)挑取，也可以根據(jù)平板菌落形態(tài)或結(jié)合生物活性圈進(jìn)行平板預(yù)篩根據(jù)形態(tài)變異淘汰低產(chǎn)菌株或篩選高產(chǎn)菌株根據(jù)平皿反應(yīng)淘汰低產(chǎn)菌株或直接挑取高產(chǎn)菌株Q:誘變育種和從自然界分離微生物相比，平板預(yù)篩對于哪個更有意義？Why？（六）高產(chǎn)菌株的分離及篩選篩選：包括初篩，復(fù)篩和終篩等。明確篩選目標(biāo)：產(chǎn)量突變還是其它突變；產(chǎn)量準(zhǔn)備提高多少等一次誘變目標(biāo)不要太高??！制定篩選方案：篩選準(zhǔn)備分幾步；篩選采用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件；每一步準(zhǔn)備篩選多少菌株；每一步準(zhǔn)備采用的分析方法等（六）高產(chǎn)菌株的分離及篩選制定篩選方案時的一些原則篩選菌株的量要根據(jù)實驗室的人力物力條件而定；初篩的目的是將大多數(shù)未變異菌株或負(fù)變菌株去除，這時解決的主要是量的問題；復(fù)篩時量的矛盾已不突出，而對準(zhǔn)確性有了更高的要求；有時要進(jìn)行幾次復(fù)篩（六）高產(chǎn)菌株的分離及篩選

出發(fā)菌株挑取200個單細(xì)胞菌株選出50株選出5株

每株各挑40株，共200株選出50株選出5株

用同樣方式進(jìn)行篩選1瓶/株誘變處理初篩復(fù)篩4瓶/株再次誘變處理初篩1瓶/株復(fù)篩4瓶/株再次誘變處理多步累積法篩選的一般步驟安全問題：各種誘變劑幾乎都有致癌作用，因此在操作中應(yīng)時刻注意安全問題個人安全：操作時注意防護(hù)；不同誘變劑要求不同防護(hù)