植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)課件

植物生理綜合實(shí)驗(yàn)細(xì)胞死活與H2O2鑒定

學(xué)號姓名植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1.了解信號物質(zhì)、激素對植物子葉的影響2.掌握細(xì)胞死活與過氧化氫鑒定方法二實(shí)驗(yàn)原理：

植物受到一些物質(zhì)處理時(shí)，會(huì)作出相應(yīng)的反應(yīng)。產(chǎn)生活性物質(zhì)（信號物質(zhì)）。一些細(xì)胞甚至?xí)劳?。這些反應(yīng)可被檢測。植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

一、茉莉酸甲酯對黃瓜子葉的作用二、一些物質(zhì)對茉莉酸甲酯作用的影響1.SNP/Hb2.乙烯利/CoCl2

3.H2O2供體/H2O2清除劑SNP（硝普鈉）是NO的供體，而NO是重要的植物信號物質(zhì)。ETH（乙烯利）是乙烯供體，乙烯是一種植物生長激素。H2O2是信號物質(zhì)，也是強(qiáng)氧化物?？梢员粰z測。植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)觀察和測定指標(biāo)

1.觀察茉莉酸甲酯處理黃瓜子葉的影響

2.細(xì)胞死活鑒定（Trypanblue）

3.活性氧的檢測（DAB、NBT活性檢測）Trypanblue：臺盼藍(lán)

DAB：二氨基聯(lián)苯胺NBT：氮藍(lán)四唑

植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)1.細(xì)胞死活的鑒定（Trypanblue）

原理：臺盼藍(lán)不能穿過活細(xì)胞質(zhì)膜，只有死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不能被染色。

過程：取10片子葉到燒杯中，加入適量的臺盼藍(lán)染液，抽真空5min，使得染液滲透進(jìn)入細(xì)胞；水浴煮沸2min，然后用2.5g/ml的水合氯醛（95％酒精）脫色至組織透明，觀察和拍照，死亡細(xì)胞被染成藍(lán)色。透明后的葉片也可以保存在50％的甘油中，以備顯微觀察。植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)2.過氧化氫活體組織的定位（DAB）

原理：H2O2在過氧化酶的催化下可與DAB迅速反應(yīng)生成棕色化合物，從而定位組織中的H2O2。植物葉片滲透（DAB）以定位H2O2是一種應(yīng)用比較普遍的組織染色方法。

取處理后的黃瓜子葉浸入1mg/mlDAB的磷酸緩沖液（0.02mol/L，pH7.0）中，抽真空5min，然后于黑暗中放置8h。將葉片置于飽和水氨醛（95％酒精）中脫去葉綠素，觀察和拍照。透明后的葉片也可以保存在在50％的甘油中，以備顯微觀察。植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)3.氮藍(lán)四唑（NBT）進(jìn)行O-組織化學(xué)定位

原理：NBT在O-的作用下還原成不溶于水的藍(lán)色二甲替，此法測定靈敏度高，常用于O-的組織化學(xué)定位。取子葉放入含有0.1％NBT的10mM磷酸緩沖液中（0.02mol/L，pH7.0）中，真空滲透5min，然后將葉片置于飽和水氨醛（95％酒精）中，水浴煮沸2min進(jìn)行固定和脫色，待葉綠素完全褪去后進(jìn)行觀察和拍照。透明后的葉片也可以保存在在50％的甘油中，以備顯微觀察。植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)種子萌發(fā)

所用的黃瓜品種為粵秀3號，采用濾紙培養(yǎng)法萌發(fā)種子。將種子均勻地拜訪在鋪有2層濾紙的保鮮盒中，加適量的水，以傾斜保鮮盒時(shí)在角底處約有1ml水為準(zhǔn)，置28℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7d子葉處理

摘取子葉整齊地?cái)[放在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中（9cm，取10對子葉），葉面朝上，葉背面貼靠濾紙，加入不同溶液進(jìn)行處理（溶液不能太多，傾斜培養(yǎng)皿時(shí)，只能有約1ml液體）。置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28℃，光照12h），培養(yǎng)1d、3d、5d取出培養(yǎng)皿觀察和拍照，然后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)7d觀察和拍照后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析4.1各小組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一組

蒸餾水

茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)蒸餾水茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)

蒸餾水茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)蒸餾水茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)

蒸餾水茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)蒸餾水植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第二組濃度為100umol/LSNP對黃瓜子葉的影響植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)200umol/LSNP處理下的黃瓜子葉植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)300umol/LSNP處理下的黃瓜子葉植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)SNP處理子葉染色后結(jié)果展示植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第三組25umol/LHb處理下的黃瓜子葉植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)50umol/LHb處理下的黃瓜子葉植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)100umol/LHb處理下的黃瓜子葉植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)Hb處理的黃瓜子葉經(jīng)染色后的變化植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第四組（過氧化氫）0.6%H2O20.8%H2O21.2%H2O210月23日植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)0.6%H2O20.9%H2O210月24日1.2%H2O2植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)0.6%H2O20.9%H2O210月26日1.2%H2O2植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)0.6%H2O20.9%H2O211月12日1.2%H2O2植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第四小組

DAB染色臺盼藍(lán)染色NBT染色

H2O2處理從左到右的順序濃度分別為0.6%、0.8%、1.2%植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)0.6g/LVc處理下的黃瓜子葉第五組Vc植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)0.8g/LVc處理下的黃瓜子葉植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)1.0g/LVc處理下的黃瓜子葉植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第六組ETH植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第六小組ETH處理植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)25umol/LCOCl2

處理下的黃瓜子葉第七組植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)50umol/LCOCl2處理下的黃瓜子葉植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)75umol/LCOCl2

處理下的黃瓜子葉植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第七小組植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)5×10-4mol/LMJ+300umol/LSNP第八組植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)5×10-6mol/LMJ+100umol/LHb植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)5×10-6mol/LMJ+1.0g/LETH植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)5×10-4mol/LMJ+75umol/LCOCl2

植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第八小組植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)5×10-4mol/LMJ+1.0g/LVc第九組植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)5×10-5mol/LMJ+1.0g/LVc植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)5×10-5mol/LMJ+1.2g/LH2O2植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)5×10-6mol/LMJ+1.2g/LH2O2植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析第一組茉莉酸甲酯由第一組的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可以看出，隨著茉莉酸甲酯的濃度的增高，植物衰老的現(xiàn)象越來越明顯，而且做細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)后，也是隨著茉莉酸甲酯的濃度越高，葉片也從透明到逐漸染成深色，這是因?yàn)殡S著茉莉酸甲酯的濃度越高，導(dǎo)致子葉片的死細(xì)胞也會(huì)越來越多，所以葉片的染色也是越來越深。茉莉酸甲酯在植物生長和發(fā)育過程中是體現(xiàn)出類似激素的作用，能夠促進(jìn)種子的萌發(fā)，植物的生長、開花、還能促進(jìn)葉片的衰老，塊莖形成，果實(shí)成熟等。從第一組的實(shí)驗(yàn)可以看出茉莉酸甲酯促進(jìn)了葉片的衰老，并且濃度越高，對細(xì)胞的衰老作用就越強(qiáng)。植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第二組硝普鈉SNP

從第二組的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可以看出，隨著硝普鈉的濃度越來越高，子葉的衰老現(xiàn)象就越來越不明顯，葉片的死細(xì)胞也越來越少，染色現(xiàn)象也越來越淺。這是由于，硝普鈉SNP是NO的供體，隨著硝普鈉SNP的濃度越高，那么培養(yǎng)基中的NO的濃度就越高。NO是具有生物活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的易擴(kuò)散分子，是植物細(xì)胞生長發(fā)育以及生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)因子。它不僅對植物的許多生命活動(dòng)如種子萌發(fā)、葉片擴(kuò)展、根系生長、逆境生理以及細(xì)胞的程序性死亡等具有直接的生理調(diào)節(jié)功能，而且作為防御反應(yīng)中的關(guān)鍵信使。NO對植物凋亡有調(diào)控作用，對植物葉片的衰老的誘導(dǎo)作用與乙烯相似?？梢酝ㄟ^調(diào)控NO的濃度水平來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。NO對子葉的影響就是延緩子葉的衰老。植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第三組牛血紅蛋白Hb

牛血紅蛋白，NO是具有生物活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的易擴(kuò)散分子，是植物細(xì)胞生長發(fā)育以及生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)因子。它不僅對植物的許多生命活動(dòng)如種子萌發(fā)、葉片擴(kuò)展、根系生長、逆境生理以及細(xì)胞的程序性死亡等具有直接的生理調(diào)節(jié)功能，而且作為防御反應(yīng)中的關(guān)鍵信使。NO對植物凋亡有調(diào)控作用，對植物葉片的衰老的誘導(dǎo)作用與乙烯相似?？梢酝ㄟ^調(diào)控NO的濃度水平來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)通過添加牛血紅蛋白，作為NO的清除劑，具有降低植物細(xì)胞內(nèi)NO濃度而起到對細(xì)胞生長衰老的調(diào)節(jié)作用。植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第四組H2O2過氧化氫從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，過氧化氫的濃度越高，那么葉片的衰老速度也就越快，在測細(xì)胞的活性時(shí)，所對應(yīng)的葉片的染色就越深，說明，高濃度的過氧化氫是促進(jìn)葉肉細(xì)胞衰老的，導(dǎo)致在高濃度的情況下葉片的死亡細(xì)胞就越多。H2O2是信號物質(zhì)，也是強(qiáng)氧化物。過氧化氫對植物葉片的生長具有促進(jìn)衰老的作用。H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，從而加速細(xì)胞的衰老和解體，是信號物質(zhì)，也是強(qiáng)氧化物。

植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第五組Vc

從第五組的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象來看，葉片并沒有因?yàn)榫S生素C的在培養(yǎng)基中的含量增多而促進(jìn)葉肉細(xì)胞的衰老，反而是因?yàn)榫S生素C含量的增多延緩了葉片的衰老。那是由于維生素C是過氧化酶的清除劑，H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，從而加速細(xì)胞的衰老和解體，是信號物質(zhì)，也是強(qiáng)氧化物。而當(dāng)加入維生素C時(shí)，則就抑制了過氧化物的作用，從而，抑制植物葉片的衰老。植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第六組ETHETH是乙烯利，是乙烯的供體，它既能促進(jìn)營養(yǎng)器官的生長，又能影響開花結(jié)果，并且在植物抗逆中發(fā)揮作用。乙烯是一種氣體，是能夠促進(jìn)衰老的植物激素。這樣是符合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的，隨著ETH的濃度升高，在培養(yǎng)皿中釋放的乙烯濃度也越來越高，葉片的衰老現(xiàn)象也越來越明顯，相對應(yīng)的葉片的染色也越來越深。植物生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)第七組CoCL2

CoCL2對葉片對起延緩衰老的作用。適宜范圍濃度的鈷對植物種子萌發(fā)，幼苗生長具有一定的促進(jìn)作用，鈷有可能通過調(diào)節(jié)活性酶和乙烯的代謝而發(fā)揮其生理作用。鈷是乙烯合成的一種