出口動(dòng)物毒素（東亞鉗蝎毒）檢驗(yàn)方法

出口動(dòng)物毒素(東亞鉗蝎毒)檢驗(yàn)方法Examinationmethodsofanimaltoxin(VenomoftheScorpionButhusmartensii)for本標(biāo)準(zhǔn)是按照GB/T1.1—1993《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1單元：標(biāo)準(zhǔn)的起草與表述規(guī)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定》的要求編寫的。采用的方法主要是中華生物毒素聯(lián)合開發(fā)中心武漢大學(xué)毒素檢驗(yàn)室1988年以來在工作實(shí)踐中使用的方法。其中急性毒性試驗(yàn)(LD?o測定)方法是采用張銑、劉毓谷教授主編《毒理學(xué)》(1997年版)中的霍恩氏(Horn)法。技術(shù)內(nèi)容稍有變動(dòng)。本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華生物毒素聯(lián)合開發(fā)中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張宗顯、劉岱岳、徐新生、趙暉、招為國。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口動(dòng)物毒素的抽樣、制樣、感官檢驗(yàn)、毒素鑒別，水份、不溶物質(zhì)、蛋白質(zhì)含量、酶活性的測定及急性毒性試驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于東亞鉗竭毒凍干粉的檢驗(yàn)。其中水分、不溶物質(zhì)、蛋白質(zhì)含量測定及急性毒性試驗(yàn)方法亦適用于其他類動(dòng)物毒素的檢驗(yàn)。2設(shè)備與材料2.1天平：普通天平，稱量1000g,感量0.01g;分析天平，稱量200g,感量0.1mg。2.2721型分光光度計(jì)或等效者。2.3烘箱，0℃~200℃。2.4培養(yǎng)箱，36℃±1℃2.5取樣工具：不銹鋼匙、盛樣瓶等。2.6恒溫水浴鍋。0℃~4℃冰箱內(nèi)。品，然后旋開瓶蓋，觀察樣品的結(jié)晶形狀、篷松狀態(tài)、色澤等。然后取適量樣品，用蒸餾水配成1%溶液，觀察其色澤及透明狀況。6.1.3結(jié)果表述a)氣味：對(duì)鼻粘膜有刺激味：或?qū)Ρ钦衬o刺激味。b)外觀：結(jié)晶形，稍篷松，潔白略帶銀灰色；或非結(jié)晶形，非篷松狀，非潔白帶銀灰色。c)溶液：均勻、半透明、乳白色；或非均勻、非半透明、非乳白色。6.2毒素鑒別試驗(yàn)(雙向瓊脂擴(kuò)散法)6.2.1方法提要：抗原(對(duì)照蝎毒和待檢蝎毒)和抗體(抗蝎毒血清)分別加入瓊脂板的小孔內(nèi)，抗原、抗體在瓊脂中自由擴(kuò)散，在濃度、比例適當(dāng)時(shí)，經(jīng)過一定時(shí)間，對(duì)應(yīng)抗原和抗體在兩孔之間形成一條沉淀線。根據(jù)沉淀線形成情況及其特征鑒別毒素的類別。6.2.2.1在記錄紙上畫一加樣板孔模型，標(biāo)出每個(gè)孔的內(nèi)容物和與玻片上瓊脂板孔相一致的號(hào)碼。取一潔凈載玻片，在其上面均勻涂一層融化的1%(W/V)無鹽瓊脂，凝固后置70℃烘干2h,再鋪一層用含有0.1%疊氮鈉的生理鹽水或0.15mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.1)配制的1%(W)瓊脂，厚度約3mm。凝固之后，置預(yù)先畫好板孔位置的記錄紙上，用打孔器對(duì)準(zhǔn)板孔位置打孔，孔徑約6.2.2.2使用30μl或40μL加樣器，將適當(dāng)稀釋的抗蝎毒血清加于瓊脂板的中間孔內(nèi)：對(duì)照蝸.毒稀釋液及不同濃度的被檢樣品稀釋液分別依次加于瓊脂板上四周孔內(nèi)，并用細(xì)玻棒排除孔內(nèi)可能存在的氣泡(見圖1)。對(duì)照蝎毒和蝎毒抗血清的濃度使用前應(yīng)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，所用濃度應(yīng)能在其兩孔之間形成清晰細(xì)微的沉淀線，達(dá)到最大的敏感度。6.2.2.3加樣后，瓊脂板被放入保持一定濕度的平皿內(nèi)，蓋上皿蓋，于37℃保溫24h或25℃保溫6.2.2.4染色：先將瓊脂板在生理鹽水中漂洗數(shù)次，去除沉淀線以外的蛋白質(zhì)，然后浸入苦味酸溶液(飽和苦味酸溶液：冰乙酸=94:6)固定10min。接著用自來水洗去酸性固定液。蓋一張濕濾紙于瓊脂板表面，置60℃左右烘干或空溫干燥。干燥后移去濾紙，再浸入0.5%氨基黑或亮藍(lán)染色液中約10min。用酸性乙醇溶液(乙醇：H.O。冰乙酸-25:25:8)進(jìn)行脫色，直到背景完全透明，取出用水沖洗干凈，即可見到清晰的免疫擴(kuò)散圖譜。6.2.2.5結(jié)果分析瓊脂板的中間孔與對(duì)照蝎毒孔及各被檢樣品稀釋液孔或部分被檢樣品稀釋液孔之間出現(xiàn)清晰可見特異沉淀線，表明被檢樣品含有與對(duì)照蝎毒相似的抗原(見圖2,圖3);中間孔僅與對(duì)照蝎毒孔之間有沉淀線，而與被檢樣品各稀釋液孔之間無沉淀線，表明被檢樣品中不含有與對(duì)照蝎毒相似的抗原(見圖4)⑤1—抗蝎毒血清；2—被檢樣品稀釋液；3—對(duì)照蝎毒稀釋液：4—被檢樣品稀釋液；5—被檢樣品稀釋液：23154353抗竭毒血清孔與對(duì)照蝎毒稀釋液孔及部分被檢樣品稀釋液孔之間形成沉淀線。32125僅抗竭毒血清孔與對(duì)照蝎毒稀釋液孔之間形成沉淀線。被檢樣品含有與對(duì)照蝎毒相似的抗原或被檢樣品不含有與對(duì)照蝎毒相似的抗原。必要時(shí)，可按附錄B提示的方法進(jìn)一步鑒別。6.3水份含量測定(常壓干燥法)6.3.1操作程序6.3.1.1將具蓋鋁制稱量皿(25mm×25mm)置105℃烘干2h,放入干燥器內(nèi)，冷卻至室溫稱量，再烘干30min稱重，如此重復(fù)直至恒重。6.3.1.2稱取待檢樣品0.1g～0.2g(W?),置于105℃烘2h,放入干燥器內(nèi)，冷卻至室溫稱重，混濁，經(jīng)3000r/min離心15min后，再行測定)。6.5.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精確量取100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：0,0.2,0.4,0.6,0.8, 空白試管ml,4.置37℃反應(yīng)30min,立即加入試 (5)機(jī)方法分為5組，每組雌、雄各5只，雌雄分開飼養(yǎng)。其中1組用作對(duì)照：其余4組供染毒試驗(yàn)。染毒前、后動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。6.7.1.2試驗(yàn)劑量：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定試驗(yàn)劑量范圍(應(yīng)包含試驗(yàn)動(dòng)物死亡率從0～100%的劑量)。按照采用的計(jì)算方法(霍恩氏法)的要求，設(shè)置4個(gè)劑量組，以101/3為劑量遞增公比，其組距為2.15倍。在竭毒LD?測定中，一般使用1.0mg/kg、2.15mg/kg、4.64mg/kg和10.0mg/劑量組系列。如果該系列中最大劑量組試驗(yàn)動(dòng)物不出現(xiàn)100%死亡率或最小劑量組的試驗(yàn)動(dòng)物死亡率不為0,可按照固定組距向上或向下調(diào)整劑量級(jí)。6.7.1.3樣品應(yīng)用液的配制：使用無菌生理鹽水將待試樣品配制成濃度分別為0.1mg/mL、0.215mg/mL、0.464mg/mL和1mg/mL的應(yīng)用液，每種濃度配制5ml。如果劑量級(jí)進(jìn)行了調(diào)整，應(yīng)按照調(diào)整后的劑量級(jí)配制相應(yīng)濃度的應(yīng)用液。6.7.1.4腹腔染毒：使用1mL注射器，按0.1ml/10g體重注射容量，以無菌操作分別對(duì)4個(gè)不同劑量組的動(dòng)物腹腔注射樣品應(yīng)用液；對(duì)照組動(dòng)物腹腔注射同量無菌生理鹽水。染毒后立即觀察動(dòng)物中毒癥狀，如癥狀出現(xiàn)的時(shí)間、臨床表現(xiàn)、死亡情況等。觀察期為14天。6.7.1.5半數(shù)致死量(LD?O)及95%可信限的計(jì)算：根據(jù)采用的試驗(yàn)劑量范圍和各劑量組動(dòng)物在觀察期內(nèi)中毒死亡的累計(jì)數(shù)，從附錄A表A1中求得被檢樣品的半數(shù)致死量(LD?o)及95%可信限。6.7.1.6結(jié)果表述半數(shù)致死量(LDso)單位以mg/kg體(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)表A1當(dāng)每組5只動(dòng)物，組距2.15時(shí)的LD計(jì)算表)5455555555555555555555555555424444444444444444444444443333333333333(提示的附錄)毛細(xì)管電泳法鑒別東亞鉗蝎毒不同的動(dòng)物毒素中含有不同的蛋白質(zhì)。東亞鉗蝎毒的主要成分為可溶性蛋白質(zhì)，其組成是具有特征性的。經(jīng)過毛細(xì)管電泳，蝸毒中的可溶性蛋白質(zhì)，依其不同的分子量，形成具有特征性的電泳圖譜。據(jù)此，可初步鑒別東亞鉗蝸毒。B2儀器和試劑B2.2磷酸鹽緩沖液：25mmol/L磷酸鹽溶液，pH6.0B2.3標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：去五肽膚島素，分子量5000;細(xì)胞色素C,分子量13000。分別用磷酸鹽緩沖液(2.2)配制成1mg/ml.標(biāo)準(zhǔn)溶液。B2.4待測試樣液：精確稱取東亞鉗蝎毒凍干粉2mg,溶解于磷酸鹽緩沖液(2.2)中，配制成1mg/mL待測試樣液。進(jìn)樣前，標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣液均經(jīng)孔徑0.45μm膜過濾。B3區(qū)帶電泳條件B3.1毛細(xì)管柱：75μn×57cm未涂覆石英柱，有效柱長50cm。B3.2進(jìn)樣方式：壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間5s。B3.3工作電壓：20kV。B3.4柱溫：20℃。據(jù)測定，東亞鉗蝎毒的毛細(xì)管電泳圖譜是具有特征性的(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1)。圖譜中出現(xiàn)6個(gè)主要蛋白質(zhì)峰，其可溶性蛋白質(zhì)的分子量在4.000～8000之間。觀測試樣測得的毛細(xì)管電泳圖譜的特征性，并與同一條件下測得的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)圖譜對(duì)照，測出試樣中可溶性蛋白質(zhì)分子量的分布范圍。若試樣的毛細(xì)管電泳