第六章 微生物代謝調(diào)控育種(4-29)

第8章推理育種8.1微生物代謝一、代謝產(chǎn)物的分類1、初級代謝產(chǎn)物分解代謝體系的酶及產(chǎn)物素材性生物合成體系的酶及底物結(jié)構(gòu)性生物合成體系的酶及產(chǎn)物2、次級代謝產(chǎn)物根據(jù)其作用，可將其分為抗生素、激素、生物堿、毒素及維生素色素等類型。28.1.1、次級代謝產(chǎn)物與次級代謝調(diào)節(jié)1.初級代謝和次級代謝

初級代謝：與生物生存有關(guān)的，涉及能量產(chǎn)生和能量消耗的代謝類型。生存必需；始終生產(chǎn)；不同種，相同；環(huán)境敏感性??；酶專一。次級代謝：某些生物為避免某種代謝物積累造成不利作用而產(chǎn)生的一類有利生存的代謝。根據(jù)其作用，可將其分為抗生素、激素、生物堿、毒素及維生素色素等類型。并非必需，但有一定價值；某一時產(chǎn)；不同種，不同；受環(huán)境敏影響大；酶專一性不強。8.2微生物代謝調(diào)節(jié)8.2.1次級代謝的調(diào)節(jié)機制8.2.1.1分解代謝中酶合成的調(diào)節(jié)1、酶合成的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)阻遏2、酶活性的調(diào)節(jié)

直線式代謝途徑中的反饋抑制；分支代謝途徑中的反饋抑制：優(yōu)先合成、協(xié)同反饋抑制、合作反饋抑制、累積反饋抑制、同工酶調(diào)節(jié)、順序反饋抑制8.2.1次級代謝的調(diào)節(jié)類型①酶合成的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)

有些酶也是誘導(dǎo)酶，以底物或底物類似物（內(nèi)源、外源）為誘導(dǎo)劑。②反饋調(diào)節(jié)次級代謝物的自身反饋抑制和反饋阻遏

末端產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)；生產(chǎn)能力與抑制濃度正相關(guān)。分解代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)

葡萄糖等一些碳、氮源及代謝產(chǎn)物有反饋抑制、阻遏作用。初級代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)；

A有共用合成途徑，反饋抑制；B初產(chǎn)物參與次合成，自反饋而影響。磷酸鹽調(diào)節(jié)；

A抑制酶的作用；B導(dǎo)致細(xì)胞能荷變化；C競爭某些金屬離子的作用。8.1.2初級代謝產(chǎn)物與次級代謝

一般認(rèn)為，次級代謝指微生物在一定生長時期，以初級代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對微生物生命活動無明確功能的物質(zhì)的過程，即為次級代謝產(chǎn)物。次級代謝與初級代謝關(guān)系密切，初級代謝的關(guān)鍵性中間產(chǎn)物往往是次級代謝的前體，如，糖降解過程中的乙酰CoA是合成四環(huán)素、紅霉素的前體；初級代謝的調(diào)節(jié)控制1、酶合成的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)阻遏2、酶活性的調(diào)節(jié)

直線式代謝途徑中的反饋抑制；分支代謝途徑中的反饋抑制：優(yōu)先合成、協(xié)同反饋抑制、合作反饋抑制、累積反饋抑制、同工酶調(diào)節(jié)、順序反饋抑制。298.2.2.2次級代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)1、次級代謝的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)

誘導(dǎo)物→刺激影響初級代謝造成代謝流改變→大量生成次級代謝產(chǎn)物（蛋氨酸提高頭孢霉素C的產(chǎn)量）（色氨酸提高麥解堿的產(chǎn)量）

誘導(dǎo)物→次級代謝物合成酶的合成→大量生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物（加入甘露聚糖誘導(dǎo)甘露聚糖酶合成，使甘露聚糖鏈霉素轉(zhuǎn)化為鏈霉素）302、次級代謝產(chǎn)物的碳源分解調(diào)節(jié)3、次級代謝產(chǎn)物氮源分解調(diào)節(jié)4、磷酸鹽的調(diào)節(jié)（直接作用和間接效應(yīng)）5、細(xì)胞膜透性的調(diào)節(jié)316、次級代謝的反饋調(diào)節(jié)（1）次級代謝自身產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)（2）分支代謝中初級代謝物的反饋調(diào)節(jié)對次級代謝的影響

次級途徑和初級途徑具有共同的分叉中間體；初級代謝的終產(chǎn)物作為前體合成次級代謝產(chǎn)物；328.3推理（代謝調(diào)控）育種

在深入研究生物合成代謝途徑以及代謝調(diào)節(jié)控制的基礎(chǔ)理論的基礎(chǔ)上，通過定向選育某種特定的突變型，以達到大量積累有益產(chǎn)物的目的。33常見的微生物代謝控制育種措施

調(diào)節(jié)體系

育種措施

誘導(dǎo)分解阻遏分解抑制1、組成型突變株2、抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育●解除碳源分解調(diào)節(jié)突變株●解除氮源分解調(diào)節(jié)突變株●解除磷酸鹽分解調(diào)節(jié)突變株

反饋阻遏反饋抑制3、營養(yǎng)缺陷型突變株4、滲漏型缺陷型突變株5、回復(fù)突變株的選育6、耐自身代謝產(chǎn)物的突變株7、抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物的突變株8、耐前體物突變株的選育9、條件突變株的選育細(xì)胞膜滲透性10、營養(yǎng)缺陷型●生物素缺陷型●油酸缺陷型●甘油缺陷型11、溫度敏感菌株348.3.1、組成型突變株的選育1、限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)2、循環(huán)培養(yǎng)3、弱誘導(dǎo)型底物4、誘導(dǎo)抑制劑5、鑒別性培養(yǎng)基35組成酶變異株的篩選

許多水解酶是誘導(dǎo)酶，只有在含有底物或底物類似物的培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)不僅需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法。1)

恒化器法：常被用于微生物的“馴化”。在培養(yǎng)基中添加不能起誘導(dǎo)作用的低濃度底物，菌生長速率極慢，而群體中少數(shù)組成型變異株則可合成有關(guān)的酶，分解利用該底物，生長速率較快。為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢，即它在群體中的比例，可以應(yīng)用恒化器培養(yǎng)技術(shù)。隨著恒化器培養(yǎng)中不斷加入新鮮基質(zhì)而逐漸增大組成酶變異株的優(yōu)勢，這樣就能夠比較容易地做進一步的純化分離。

2)

循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境進行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。當(dāng)接種到不含誘導(dǎo)物而含有其它可利用碳源的培養(yǎng)基中時，兩種類型菌株同樣能較好地生長，但在此環(huán)境中組成型突變株已能合成有關(guān)的水解酶，而誘導(dǎo)型菌株就不能合成。

將它們轉(zhuǎn)接入含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中時，變異株能迅速利用誘導(dǎo)底物進行生長繁殖，而誘導(dǎo)型出發(fā)菌株需經(jīng)歷一個誘導(dǎo)合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步，組成酶變異株所占的比例將逐漸增大。３、組成型突變株篩選

誘導(dǎo)型依賴誘導(dǎo)物。組成型不依賴誘導(dǎo)物。突變發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或操縱基因,解除對誘導(dǎo)物的依賴,可獲組成型突變株。篩選方法：設(shè)計條件使組成型優(yōu)勢生長，或通過菌落分辨。

①加誘導(dǎo)酶合成抑制物②交替培養(yǎng)法③顯色反應(yīng)法篩選方法①加誘導(dǎo)酶合成抑制物如：加鄰硝基-β-D-巖藻糖苷，抑制-β半乳糖苷酶合成。誘導(dǎo)型不能利用乳糖，不長；組成型產(chǎn)酶，能利用乳糖，生長，被富集。

②交替培養(yǎng)法含誘導(dǎo)物（乳糖）中培養(yǎng)——組成型快——不含誘導(dǎo)物（葡萄糖）中培養(yǎng)——誘導(dǎo)型失酶——反復(fù)。③顯色反應(yīng)法不含誘導(dǎo)物平板培養(yǎng)——加底物——分解（有顏色變化）——檢出。

４.抗（敏感）性突變株篩選包括：抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體

①抗生素抗性突變：提高產(chǎn)量；

②抗噬菌體突變：消除噬菌體污染；

（與噬菌體存在與否無關(guān)）③條件抗性突變：如溫度，可提高產(chǎn)量；

（溫度敏感突變，高溫呈營養(yǎng)缺陷表型）

④物敏突變：如：氟乙酸抑制順烏頭酸酶，氟乙酸敏感突變型，順烏頭酸酶活性極低，更敏感，異檸檬酸產(chǎn)量少，檸檬酸積累。

8.3.2抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育8.3.3、營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選及應(yīng)用1、誘發(fā)突變2、中間培養(yǎng)3、淘汰野生型青霉素濃縮法過濾濃縮法464、營養(yǎng)缺陷型的檢出逐個測定法夾層檢出法限量補充培養(yǎng)基檢出法影印平板法475、生長譜的確定缺陷型菌株平皿的制備缺陷營養(yǎng)類別的確定單一營養(yǎng)因素缺陷型生長因素的確定營養(yǎng)成分編組48營養(yǎng)缺陷型的應(yīng)用

利用營養(yǎng)缺陷型突變株來生產(chǎn)氨基酸和核苷酸是典型的例子

天冬氨酸激酶(AK)被賴氨酸及蘇氨酸協(xié)同反饋所抑制通過誘變處理，獲得高絲氨酸缺陷型突變菌株，該突變型不能產(chǎn)生蘇氨酸。在限量高絲氨酸的培養(yǎng)基中缺陷型菌株能夠正常生長，并且因為消除了反饋抑制突變型能過量生產(chǎn)L-賴氨酸三、抗反饋調(diào)節(jié)抗性突變株的獲取及應(yīng)用1、基本概念（1）什么是抗反饋調(diào)節(jié)突變株

一種解除合成代謝反饋調(diào)節(jié)機制的突變型菌株。（2）抗反饋調(diào)節(jié)突變株的特點

目標(biāo)產(chǎn)物不斷積累，不會因其濃度超量而終止生產(chǎn)；52

（3）抗反饋調(diào)節(jié)的基本類型

抗饋突變型：結(jié)構(gòu)基因突變使變構(gòu)酶不能與代謝終產(chǎn)物相結(jié)合；抗阻遏突變型：調(diào)節(jié)基因突變引起調(diào)節(jié)蛋白不能和代謝終產(chǎn)物結(jié)合而失去阻遏作用；或操縱基因突變不能與活性阻遏蛋白結(jié)合。（4）篩選方法

濃度梯度平板法53

（2）回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)株

什么是回復(fù)突變株？回復(fù)突變的基因型有哪幾類？該類菌株高產(chǎn)的原理是什么?

如何篩選該類菌株？55（3）累積前體和耐前體突變株的選育

什么是累積前體和耐前體突變株？為什么耐前體毒性突變株可以獲得高產(chǎn)？如何篩選耐前體突變株？56四、細(xì)胞膜透性突變株1、營養(yǎng)缺陷型突變株導(dǎo)致細(xì)胞膜透性改變；2、溫度敏感突變株導(dǎo)致細(xì)胞膜透性改變；3、溶菌酶敏感突變株導(dǎo)致的細(xì)胞膜透性改變58抑制天冬氨酸中間產(chǎn)物Ⅰ中間產(chǎn)物Ⅱ高絲氨酸蘇氨酸賴氨酸天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶+甲硫氨酸黃色短桿菌合成賴氨酸的途徑NH4+抑制葡萄糖中間產(chǎn)物α-酮戊二酸谷氨酸谷氨酸脫氫酶谷氨酸棒狀桿菌合成谷氨酸的途徑微生物的代謝的人工控制目的

最大限度的積累對人類有用的代謝產(chǎn)物措施改變微生物細(xì)胞膜的通透性改變微生物的遺傳特性（誘變、重組等）控制發(fā)酵條件（如溫度、PH、O2等）發(fā)酵概念通過微生物的培養(yǎng)，大量生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物的過程種類1、固體發(fā)酵和液體發(fā)酵2、抗生素發(fā)酵、維生素發(fā)酵、氨基酸發(fā)酵等3、需氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵微生物代謝的人工控制——改變膜的透性改變細(xì)胞膜的透性，使谷氨酸迅速排放到細(xì)胞外面，解除谷氨酸的抑制作用。抑制葡萄糖中間產(chǎn)物α-酮戊二酸谷氨酸谷氨酸脫氫酶NH4+谷氨酸棒狀桿菌合成谷氨酸的途徑抑制黃色短桿菌合成賴氨酸的途徑天冬氨酸中間產(chǎn)物Ⅰ中間產(chǎn)物Ⅱ高絲氨酸甲硫氨酸蘇氨酸賴氨酸天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶+利用誘變育種等方法，選育不能合成高絲氨酸脫氫酶的菌種用于生產(chǎn).微生物代謝的人工控制——改變遺傳特性O(shè)2：如：酵母菌在有氧條件下大量繁殖，在無氧條件下才大量產(chǎn)生酒精。又如：谷氨酸棒狀桿菌在溶氧不足時，生成的產(chǎn)物是乳酸或是琥珀酸。C：N

如在谷氨酸發(fā)酵過程中，當(dāng)培養(yǎng)基中C：N=4：1時，菌體大量繁殖而產(chǎn)生谷氨酸少；當(dāng)C：N=3：1時，菌體繁殖受抑制而合成谷氨酸多微生物代謝的人工控制——改變發(fā)酵條件微生物的生長生長曲線時間調(diào)整期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期菌體數(shù)目代謝特點時間細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)增長不明顯快速增長活菌數(shù)目達到最大（K值）活菌數(shù)目急劇減少代謝活躍體積增大大量合成初級代謝產(chǎn)物細(xì)胞分裂速率最快個體形態(tài)、生理特征較穩(wěn)定繁殖速率等于死亡速率細(xì)胞內(nèi)大量積累次級代謝產(chǎn)物，某些細(xì)菌可形成芽孢繁殖速率小于死亡速率菌體出現(xiàn)多種形態(tài)（畸形），細(xì)胞解體、釋放代謝產(chǎn)物微生物的生長生長曲線時間調(diào)整期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期成因應(yīng)用及其他時間細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)適應(yīng)新環(huán)境適應(yīng)了環(huán)境后，條件適宜、營養(yǎng)物質(zhì)充足等營養(yǎng)物質(zhì)消耗、有毒代謝產(chǎn)物積累、PH值的變化，種內(nèi)斗爭加劇生存條件極度惡化，有毒代謝產(chǎn)物積累過，生存斗爭最劇烈長短與菌種、培養(yǎng)條件有關(guān)可作為菌種也可作科研材料制取代謝產(chǎn)物特別是次級產(chǎn)物，第8章微生物優(yōu)良菌種的選育微生物發(fā)酵的一般流程種子擴大培養(yǎng)培養(yǎng)基配制空氣除菌培養(yǎng)基滅菌發(fā)酵生產(chǎn)下游處理發(fā)酵設(shè)備提綱微生物優(yōu)良生產(chǎn)菌種的特征自然突變選育誘變選育

原理基本方法雜交育種

細(xì)菌放線菌霉菌酵母菌原生質(zhì)體融合基因工程技術(shù)基因表達系統(tǒng)利用大腸桿菌的基因表達系統(tǒng)利用酵母菌的基因表達系統(tǒng)基因工程菌的穩(wěn)定性優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征對菌種的要求

天然菌種的生產(chǎn)性能較低，一般需要進行選育。1.生產(chǎn)力：能在廉價的培養(yǎng)基上迅速生長，所需的代謝產(chǎn)

物的產(chǎn)量高，其它代謝產(chǎn)物少2.操作性：培養(yǎng)條件簡單，發(fā)酵易控制，產(chǎn)品易分離3.穩(wěn)定性：抗噬菌體能力強，菌種純，不易變異退化4.安全性：是非病源菌，不產(chǎn)有害生物活性物質(zhì)或毒素優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征選擇生產(chǎn)菌種應(yīng)注意的因素1.原料方面：廣，轉(zhuǎn)化率高；2.產(chǎn)物方面：目的產(chǎn)物含量高，副產(chǎn)物少；3.菌體方面：生長快、繁殖力強，耐受力強，抗污染、抗噬菌體能力強，遺傳特性穩(wěn)定4.設(shè)備方面：產(chǎn)泡沫少，適宜大罐生產(chǎn)。（培養(yǎng)條件異，周期短，需氧量小，抗污染能力強）

一、自然選育利用微生物自然突變進行的菌種選育。原因：多因素低劑量的誘