T-QBAA 001-2023 釀酒酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量的測定 高效液相色譜法

0ICS65.200CCSB46團 體 T/QBAA001—2023釀酒酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量的測定高效液相色譜法Siit tDeerminatonofmannancontentinyeasculure(Siit tHighperformancel-

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-中關村量子生物農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟 發(fā)

布

T/QBAA001—2023前 言本文件按照

GB/T1.化工作導則 第1部分:化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由中關村量子生物農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟化技術委員會提并歸口。本文件起草單位:北京農(nóng)學院、北京中農(nóng)弘科生物技術有限公司、安琪酵母股份有限公司、安徽東方新新生物技術有限公司、中農(nóng)業(yè)大學、北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司、鐵騎力士食品有限責任公司、河北弘科榮達生物技術有限公司。本文件主要起草人:劉明、王宗義、蔣林樹、王文歡、覃先武、謝申猛、陸文清、曹云鶴、周建川、白秀梅、董彥君、趙學軍、戴晉軍、夏冰、徐建晨、周俊言、龐遠祥、劉茹、劉運平、趙莉莉、張云常、王慧、劉真。T/QBAA001—2023引 言本文件的發(fā)布機構提請注意,聲明符合本文件時,可能涉及與《一種酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖的檢測Z方法》(L201710219300.)相關的專利的使用。Z本文件的發(fā)布機構對該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機構承諾,他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下,就該專利授權許可進行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機構備案。相關信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得:專利持有人姓名:北京中農(nóng)弘科生物技術有限公司。地址:北京市昌平區(qū)中關村生命科學園北清創(chuàng)意園請注意除上述專利外,本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。T/QBAA001—2023釀酒酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量的測定高效液相色譜法1

范圍本文件描述了釀酒酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量的高效液相色譜測定方法。本文件適用于釀酒酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖的測定。2

規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682

分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20195

動物飼料 試樣的制備3

術語和定義下列術語和定義適用于本文件。13.123.2

Siit t釀酒酵母培養(yǎng)物

yeasculureSiit tS以釀酒酵母(accharomycescereviiae)為菌種,經(jīng)固體發(fā)酵后,濃縮、干燥獲得的產(chǎn)品。S甘露聚糖

mannan6 2 3以α-1,-甘露糖為骨架鏈,由α-1,

或α6 2 34

原理樣品經(jīng)酸水解,使甘露聚糖轉(zhuǎn)化為甘露糖,以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮為衍生劑進行衍生,經(jīng)高效液相色譜分離,紫外檢測器檢測,外法進行定量。將測得的甘露糖含量通過轉(zhuǎn)化系數(shù)校正,計算得到甘露聚糖的含量。5

試劑和材料15. 試劑111125..水:GB/T6682,一級水。11125.. 濃鹽酸(HCl):分析純。1314 ( 2155.. 1314 ( 2155.. 二氯甲烷

CH2Cl):分析純。5.. 甲醇(CH3OH):色譜純。1T/QBAA001—2023165.. 乙腈(CH3CN):色譜純。16175.. 乙酸銨(CH3COONH4):色譜純。171825..

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(C10H10N2O):分析純。1825. 試劑配制 6215.. 氫氧化鈉溶液(

mol/L):稱取120g(精確至0.1g)氫氧化鈉,緩緩加入盛有 621水的燒杯中,使其完全溶解,待溶液冷卻后,移至500mL容量瓶中,定容。 /(3225..氫氧化鈉溶液

0.molL):稱取6g(精確至0.1g)氫氧化鈉,緩緩加入盛有200 /(322水的燒杯中,使其完全溶解,待溶液冷卻后,轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中,定容。 /(3 5235.. 鹽酸溶液

0.molL):移取12.mL(精確至0.1mL) /(3 523的燒杯中,待溶液冷卻后,轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中,定容。 (5 3245..

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液

0.

mol/L):稱取4.5g的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 (5 324甲醇溶解

,定容至50mL,即配即用。 /(1 2255.. 乙酸銨溶液

0.molL):稱取7.08g的乙酸銨,加入適量水溶解 /(1 225的濾膜后備用。35. 品3C C甘露糖(6H12O6,AS號3458-28-4):純度≥98%,C C45. 甘露糖溶液4 (415.. 儲備溶液

1000mg/L):稱取甘露糖品0.5g(精確至0.001g),用水溶解并定容 (4150mL容量瓶中,搖勻,于儲液瓶中4℃保存,有效期為7d,使用前放置至室溫。 1 (4.425.. 中間溶液(00mg/L):移取5mL儲備溶液

5.1)于50mL 1 (4.42配即用。 ( 2)

50 0000 00430 0 013 45.. 系列工作溶液:分別移取中 ( 2)

50 0000 00430 0 013 44.0mL和5.0mL于10mL容量瓶中,用水定容,得到質(zhì)量濃度分別為5.0μg/mL、0.0μg/mL、20.0μg/mL、0.0μg/mL、0.0μg/mL和50.0μg/mL的系列工作溶液。即配即用。55. 材料5 15152 1 5 :0.535.. 15152 1 5 :0.535..

塑料離心管:5mL,0mL,帶螺口蓋。5.. 濾膜 22μm,水系。 0p54555..

pH精密試紙:H

范圍為 0p54555.. 定量濾紙。6

儀器1236. 高效液相色譜儀:配有紫外檢測器。1236. 分析天平:感量0.001g和0.01g。6. 離心機:轉(zhuǎn)速≥8000r/min。 2 4 14 1566. 高壓滅菌鍋:工作壓力0.MPa~0.MPa,工作溫度121℃~134℃ 2 4 14 1566.恒溫水浴鍋:控溫精度±0.

℃。6. 渦旋振蕩器

。2時間/minA/%B/%0.00752510.00752511.00010014.00010014.10752520.007525T/QBAA001—20237

樣品4按照GB/T20195制備樣品,至少200g,粉碎使其完全通過0.25mm

孔徑的分析篩,充分混勻,裝4入磨口瓶中,備用。8

試驗步驟18. 水解15 0 (1.(2. 22確稱取0.g~1.g試樣(精確至0.001g)于50mL塑料離心管中5 0 (1.(2. 22緊離心管蓋,于渦旋振蕩器上渦旋2min,充分浸潤混勻,全部轉(zhuǎn)入150mL三角瓶中,用50mL水分數(shù)次清洗離心管,清洗液并入三角瓶中,塞上瓶口塞,置于高壓滅菌鍋121℃水解60min。取冷卻至室溫,使用氫氧化鈉水溶液

5.1和5..)調(diào)水解液pH

至中性,轉(zhuǎn)移水解液至100mL容量瓶中,用水定容。取適量水解液過濾,濾液備用。高甘露聚糖含量試樣,過濾液需適當用水稀釋后備用。28. 衍生2(1) 5524

03 l 5223 l 5235 55 2吸取濾液

8.400μL于15mL塑料離心管中,加入0.

mol/L1-苯(1) 5524

03 l 5223 l 5235 55 2(..)、.mo/L氫氧化鈉溶液(..)各400μL,充分混勻,于70℃水浴衍生化反應60min。取冷卻至室溫,加入0.mo/L鹽酸溶液(..)00μL,混勻。加入2.mL二氯甲烷,渦旋30s,3000r/min離心5min,棄去下層二氯甲烷相,上層水相使用2.mL二氯甲烷重復萃取3次,最后取上層水相,過0.2μm濾膜,待測定。(4.同樣方法對系列工作溶液

5.3)(4.38. 測定3318.. 色譜條件31色譜條件如下。C 63———色譜柱:18柱,柱長250mm,內(nèi)徑4.mm,粒徑5μm;C 63———柱溫:5℃。22———檢測波長:50nm。22———進樣量:0μL。1 (5.5

B (1.:0———流動相:A為0.1 (5.5

B (1.:0———流動相流速

1.mL/min。流動相洗脫參考程序見表1。表表1

流動相洗脫參考程序3m ×106

×100%

…………(1m ×106

×100%

…………(1)328.. 曲線的制作32(2)(5.3 1將經(jīng)衍生化處理后的系列工作溶液

8.

在上述色譜條件下確進樣(2)(5.3 1溶液4.)濃度為橫坐、峰面積為縱坐,繪制曲線。溶液衍生色譜圖見附錄

A中圖

A.。338.. 試樣溶液的測定33 (2)3318... 定性分析:將經(jīng)衍生化處理后的樣品水解液

8. (2)3315 2條件下,試樣溶液中目物的保留時間與工作溶液中甘露糖衍生物的保留時間相比,偏差應5 2±2.%范圍內(nèi)。樣品水解液衍生色譜圖見圖

A.。3328... 定量檢測:在定性分析的基礎上,將得到的峰面積代入曲線方程,計算得最終試樣溶液甘露糖的質(zhì)量濃度。3329

試驗數(shù)據(jù)處理1試樣中甘露聚糖的含量按式()計算:19X

=ρ

×V×n

×0.9式中:X

———甘露聚糖含量;μρ

———由曲線計算獲得樣品水解液中甘露糖的質(zhì)量濃度,單位為微克每毫升(g/mL);μV

———水解液定容體積,單位為毫升(mL);n

———水解液稀釋倍數(shù);9g0.