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化妝品光毒性試驗(yàn)聯(lián)合紅細(xì)胞測定法白。因此,血紅蛋白氧化也稱高鐵血紅蛋白形成(methaemoglobininformation,MetHbinformation),血紅蛋白氧化值也稱高鐵血紅蛋白形成值,可以通過用TritomX-100溶解剩余細(xì)胞并測定其630nm處的光密度值來得到。H指的是50%溶血值,能使紅細(xì)胞出現(xiàn)50%溶血的被試物質(zhì)的濃度。F(+/-)haemolysisfactorF(+/-)指的是溶血因子,可以預(yù)測被試物質(zhì)光毒性潛能,等于避光板和光照板的H之比。表示高鐵血紅蛋白的最大形成值,可以預(yù)測被試物質(zhì)的光毒性潛能。4方法原理在有光毒性物質(zhì)存在時,紅細(xì)胞受輻照后可以造成血紅蛋白氧化(形成高鐵血紅蛋白)和紅細(xì)胞溶解?;衔锏墓舛拘詽摿梢酝ㄟ^測定該化合物在紫外光(UV)和可見光(太陽光)照射下對紅細(xì)胞膜損傷和/或氧化血紅蛋自(蛋自質(zhì)相關(guān)的光損傷)的能力來評價。其中,紅細(xì)胞溶解程度可以通過測定釋放到上清液中的血紅蛋白量來確定,即540nm處的光密度值;血紅蛋白氧化可以發(fā)生在溶解后的細(xì)胞外,也可以發(fā)生在細(xì)胞內(nèi),總的血紅蛋自氧化能力(高鐵血紅蛋白形成值)可以通過用TritonX-100溶解剩余細(xì)胞并測定其630nm處的光密度值來得到。5主要設(shè)備5.1酶標(biāo)儀(波長范圍400nm~750mm)。5.2光源(太陽光模擬器,配備500W的金屬內(nèi)化物燈和305nm的H,燈柵,如SOL.500,Honle,Mu-5.3輻照計(光照強(qiáng)度UVA=1.67mW/cm2,UVB=0.1MW/cm2;照射150min后,UVA劑量=15J/cm2,UVB5.4離心管(10mL)。5.524孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunc)。5.6微量板離心機(jī)。5.7微量可調(diào)移液器(2pL,10pL,100μL,1000yL)及相應(yīng)的吸頭。6試驗(yàn)準(zhǔn)備6.1紅細(xì)胞的制備;采集人或者其他哺乳動物(如犢牛、豬、綿羊和兔子)的抗凝血100mL,洗滌3次,以去除血漿和白細(xì)胞層。用PBS(配制見附錄A.1)制備40%的細(xì)胞懸液,每100mL血液可以制得5份×10mL的紅細(xì)胞懸液,每份紅細(xì)胞懸液足夠10塊24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的用量,4℃保存?zhèn)溆?最多可以保存1周)。試驗(yàn)之前,1份紅細(xì)胞懸液用PBS調(diào)整至ODm≈2,06.2陽性對照:陽性對照為氯丙噪,被度范圍從1mg/l~300mg/L.,血,但前者的溶血程度強(qiáng)于后者。6.3陰性對照:陰性對照為SDS,濃度范圍從1mg/L~100mg/L,為止。在光照板和避光板都可以出現(xiàn)溶在光照板和避光板上的溶血程度和高鐵血紅蛋白形成沒有差異。6.4無細(xì)胞化學(xué)物空白對照:被試物質(zhì)的每個濃度都設(shè)一個不加紅細(xì)胞的空白對照,其他處理相同。6.5PBS空白對照:每個反應(yīng)板都設(shè)PBS或PBS+溶劑對照,其他處理相同。6.6蒸餾水100%溶解對照:每個反應(yīng)板都設(shè)蒸餾水或含有10%溶劑的蒸餾水產(chǎn)生100%溶血對照,其他處理相同。6.7溶劑的選擇和被試物質(zhì)的溶解:被試化學(xué)物質(zhì)應(yīng)當(dāng)溶解在適當(dāng)溶劑里才能進(jìn)行測試,一般選擇PBS,如果在PBS中不能溶解,可以選擇乙醇或DMSO,乙醇或DMSO的最大終濃度應(yīng)為10%,各個濃度的樣品都要使用相同濃度的溶劑來處理,溶劑的選擇參見附錄B。每個測試濃度都作為一個獨(dú)立的樣品進(jìn)行檢測,每個被試物質(zhì)要包括9個濃度范圍:1mg/1.,3mg/L、10mg/L.,30mg/L.,100mg/L.、300mg/L,1000mg/L,3000mg/L和10000mg/L(質(zhì)量濃度)。6.8PBS洗滌液:配制方法見A.1。6.9檸檬酸緩沖液(抗凝劑);配制見A.2。6.10DMSO?分析純級。6.11乙醇:分析純級。7試驗(yàn)過程7.1范國測定實(shí)驗(yàn)7.1.1溶血范圍測定7.1.1.1范圍測定試驗(yàn)需要2塊24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每塊培養(yǎng)板必須設(shè)2個蒸餾水100%溶解對照(Aqua+)、2個PBS空白對照(PBS+)、樣品的9個測試濃度(C1~C9)及每個濃度的無細(xì)胞化學(xué)物空白對照(CB1~CB9),范圍測定設(shè)計方案參見表B.1。7.1.1.2將紅細(xì)胞懸液加入到溶解在PBS或者PBS/乙醇《或DMSO)的被試物質(zhì)中,24孔板最終體積為每孔1mL,對照孔中也加入不同的對照物,參見表B,1。7.1.1.3微量板經(jīng)適當(dāng)密封后,短暫振搖,室溫放置測試。7.1.1.4一塊板輻照150min(光照板),另一塊放于黑暗中避光(避光板),其他條件完全相同,解育過程中至少要振搖2次。7.1.1.5輻照結(jié)束后.兩塊板都在黑暗中室溫靜置30min進(jìn)行后解育。7.1.1.6解育結(jié)束后,800g~800g離心10min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的做孔板的相應(yīng)孔內(nèi)。7.1.1.7用酶標(biāo)僅測定540nm的光密度值。7.1.2血紅蛋白氧化范圍測定7.1.2.1~7.1,2.5與7,1.1.1~7,1,1.5完全相同。7.1.2.6黑暗處孵育結(jié)束后,每孔立即加人100μl.新配制的1%TritonX-100溶液,振搖5min。7.1.2.7600g~800g離心10min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的微孔板的相應(yīng)孔內(nèi)。7.1.2.8用酶標(biāo)僅測定630nm的光密度值。7.2溶血試驗(yàn)7.2.1溶血范圍測定試驗(yàn)結(jié)果,如果避光板和光照板都沒有溶血反應(yīng),不需要進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。7.2.2溶血范圍測定試驗(yàn)結(jié)果,如果只有光照板出現(xiàn)溶血、避光板無溶血反應(yīng),需要按7.2.4方法繼續(xù)7.2.3溶血范圍測定試驗(yàn)結(jié)果,如果避光板和光照板都有溶血,需要按7.2.4測定H值。DOD=[OD(+)-CkBI]-[OD(-)-Cha]……(3)A.1磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7,4)NaClNa?HPO,24孔細(xì)胞培養(yǎng)板設(shè)計方案123456ABCDCB1~CB9;無紅細(xì)胞孔的已知9個測試濃度的樣品(化學(xué)物空白對照,濃度與C
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