生殖細(xì)胞工程課件

第五章植物生殖細(xì)胞工程11、花藥、花粉培養(yǎng)的基本概念及意義2、花藥培養(yǎng)程序3、花粉及小孢子培養(yǎng)程序4、花藥和花粉培養(yǎng)中雄核發(fā)育的途徑及影響因素5、單倍體形成的途徑6、花藥及花粉植物的倍性及染色體加倍第一節(jié)花藥與花粉培養(yǎng)2Ovary花柱柱頭花絲子房花瓣34花藥是位于花絲頂端的結(jié)構(gòu),可以算做是器官；花粉是花藥里的花粉母細(xì)胞(或小孢子母細(xì)胞)通過(guò)一次減數(shù)分裂產(chǎn)生四個(gè)花粉粒（也叫小孢子，其中三個(gè)退化，另一個(gè)再通過(guò)一次有絲分裂形成兩個(gè)精細(xì)胞）。油菜成熟花藥的結(jié)構(gòu)花粉囊花粉囊壁成熟花粉?；ㄋ幜芽诨ㄋ?花粉51、花藥、花粉培養(yǎng)的基本概念及意義花藥培養(yǎng)&花粉培養(yǎng)6花粉粒(n)藥隔組織(2n)藥壁(2n)花絲(2n)擬南芥花藥7(2)花粉培養(yǎng)(pollenculture)又叫小孢子培養(yǎng)(microsporeculture):從花藥中分離出花粉粒，使之成為分散的或游離的狀態(tài)，通過(guò)培養(yǎng)使藥粉粒脫分化，進(jìn)而發(fā)育成完整的植株的過(guò)程。

花粉的發(fā)育期：花粉母細(xì)胞－四分體期－小孢子早期、中期和晚期－有絲分裂期和雙核花粉期（營(yíng)養(yǎng)核和生殖核）一般將處于四分體到單核早期的花粉稱小孢子；進(jìn)入單核以后則稱為花粉。生殖核再次有絲分裂，形成兩個(gè)精子在花粉粒中進(jìn)行，形成三細(xì)胞花粉，如白菜、小麥等在花粉管中進(jìn)行，形成二細(xì)胞花粉，如煙草、棉花等892）花藥、花粉培養(yǎng)的意義A.縮短育種年限按照常規(guī)育種，雜種從F2代開(kāi)始分離，繼續(xù)自交，通過(guò)不斷選擇和淘汰，一般需到F5-F6代才能得到基因型純合的后代。用花藥或花粉（n）培養(yǎng)，先得到單倍體植株，再進(jìn)行染色體加倍，即可獲得純合二倍體（2n）。這樣，從雜交到純合株系，只需2個(gè)世代，即可縮短3-4個(gè)育種世代。10B.提高選擇效率F1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂形成各種各樣配子類型，進(jìn)而發(fā)育成花粉。用花粉培養(yǎng)獲得單倍體再生植株（n），配子基因型在再生植物體中完全表達(dá)，即再生植物基因型也是多種多樣的，這為選育種提供了很廣泛的變異類型。特別是隱性基因也可以得到充分的表達(dá)。因此，將花藥花粉培養(yǎng)與常規(guī)育種相結(jié)合，就能大大提高育種選擇的效率。112、花藥培養(yǎng)程序外植體的選擇材料的表面滅菌接種培養(yǎng)與植物再生生根與移栽121）外植體的選擇－直接關(guān)系到培養(yǎng)能否成功。－供試材料的遺傳背景－供試材料的生理狀態(tài)多年生植物中，幼年植株比老齡植物的花藥誘導(dǎo)頻率高；草本植物生長(zhǎng)好、處于生殖生長(zhǎng)高峰期的花藥好，而徒長(zhǎng)或營(yíng)養(yǎng)不良的植物花藥較差。

13減數(shù)分裂過(guò)程圖解示意1.細(xì)線期2.凝線期3.染色體聚集成“花朵狀”4.偶線期5.粗線期6.雙線期7.終變期

8-9.中期I10.后期I11.末期I

12.二分體(減數(shù)分裂間期)13.前期Ⅱ14.中期Ⅱ

15.后期Ⅱ16.末期Ⅱ17.四分體18.幼齡單核花粉粒－花粉的發(fā)育時(shí)期大多數(shù)植物而言，當(dāng)花粉發(fā)育處于單核中期到單核晚期的花藥較好。花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂(引自李揚(yáng)漢)14152）材料預(yù)處理和滅菌--材料預(yù)處理：不同的植物種類、品種和生理狀態(tài)所要求的預(yù)處理不同。預(yù)處理方式：高溫、低溫、離心、預(yù)培養(yǎng)預(yù)處理的目的：從形態(tài)上改變其極性分布，從生理生化上改變其細(xì)胞生理狀態(tài)，以改變其分列方式和發(fā)育途徑。--合適的滅菌方法：經(jīng)過(guò)預(yù)處理的材料多采用70％乙醇浸泡花蕾或幼穗1min，然后在飽和漂白粉溶液中浸泡10-15min，無(wú)菌水沖洗3-5次即可。161718193、花粉培養(yǎng)程序取材時(shí)期的確定及預(yù)處理花粉的分離花粉培養(yǎng)方法材料的滅菌201）取材時(shí)期的確定及預(yù)處理取材時(shí)期的確定:較花藥培養(yǎng)的取材時(shí)期更早，大多在花粉處于四分體到單核早期。通過(guò)鏡檢觀察花粉的發(fā)育時(shí)期，根據(jù)發(fā)育時(shí)期與花蕾大小、外觀形態(tài)和顏色等指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系，選擇適宜時(shí)期的花蕾。21預(yù)處理:預(yù)處理可以提高獲得再生植株的頻率，可采用低溫、高溫或預(yù)培養(yǎng)等方式。一般低溫處理是在3-5℃處理3-10天，高溫處理則在35℃處理1-3天。為避免花蕾失水，可將花蕾置于裝有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，完成溫度預(yù)處理。222）花粉的分離

花藥有藥壁(2n)、藥隔(2n)、花粉(n)等，因此，再生植株有可能來(lái)自藥壁(2n)、藥隔(2n)、或起源于多個(gè)花粉(n)的嵌合體。如果采用游離花粉粒進(jìn)行培養(yǎng)，則再生植株一般為同質(zhì)體?；ǚ鄯蛛x的方法：擠壓法、自然釋放法和器械法。花粉粒(n)藥隔組織(2n)藥壁(2n)花絲(2n)23過(guò)濾（孔徑比花粉直徑大10μm）加入液體培養(yǎng)基懸浮，100-1000r/m離心1-5min，棄上清。重復(fù)2-3次計(jì)數(shù)確定接種密度，104-105個(gè)/mL將花藥置于液體培養(yǎng)中或與培養(yǎng)基等滲的蔗糖溶液中，用玻璃棒或注射器內(nèi)管擠壓花藥，使其散出花粉特點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，但可能對(duì)花粉有一定的損傷。

（1）擠壓法24（2）自然釋放法將花藥接種于液體培養(yǎng)基中，1-7d后待花藥自然開(kāi)裂，釋放出花粉。特點(diǎn)：對(duì)花粉無(wú)損傷，但分離出花粉數(shù)量相對(duì)較少。（3）器械法將花藥接種于液體培養(yǎng)基中，放入磁棒，在磁力攪拌器上，低速轉(zhuǎn)至花藥呈透明狀。特點(diǎn)：分離較徹底，但對(duì)花粉有不同程度的機(jī)械損傷。253）花粉培養(yǎng)方法

看護(hù)培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)（微室培養(yǎng)）、液體淺層培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)（1）看護(hù)培養(yǎng)26（2）微室培養(yǎng)27（3）液體淺層培養(yǎng)與雙層培養(yǎng)284、花藥和花粉培養(yǎng)中雄核發(fā)育的途徑及影響因素正常條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)核生殖核營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞萌發(fā)形成花粉管進(jìn)行正常的受精29花藥、花粉培養(yǎng)中，花粉的發(fā)育可能出現(xiàn)的5種情況：

敗育變成肥大花粉花粉發(fā)芽經(jīng)愈傷組織形成不定芽30敗育變成肥大花粉花粉發(fā)芽經(jīng)愈傷組織形成不定芽離體條件下花粉的發(fā)育形態(tài)312）影響雄核發(fā)育的因素（1）供體植株的基因型基因型是影響花藥和花粉培養(yǎng)形成單倍體最重要的因素之一。不同植物屬間、種間或品種間均存在很大的差異。茄科、十字花科作物花藥和花粉培養(yǎng)較易培養(yǎng)成功。水稻中粳稻比秈稻容易培養(yǎng)，粳稻的花藥愈傷誘導(dǎo)率平均可達(dá)10％，而秈稻只有1-2％；在31個(gè)大豆栽培種中，所有的基因型都產(chǎn)生了愈傷組織，但誘導(dǎo)率的變異范圍為％32（2）供體植株的生理狀態(tài)供體植株的生理狀態(tài)對(duì)花藥培養(yǎng)效率有直接的影響（初花期至盛花期較好；花序年齡等）。特別是供體植株所處的環(huán)境條件會(huì)影響到花藥對(duì)離體培養(yǎng)的反應(yīng)，這些環(huán)境因子有光照強(qiáng)度、光周期、溫度、營(yíng)養(yǎng)條件等。

3334（4）預(yù)處理將花粉或花藥從植株上取下來(lái)直接培養(yǎng)，往往誘導(dǎo)率很低。而采用低溫、高溫、離心等預(yù)處理，則可以促進(jìn)花粉細(xì)胞的啟動(dòng)，顯著提高再生頻率。A.低溫處理：一般將欲接種的材料置于0-10℃的條件下處理3-10d。

3536373839(6)藥壁因子40412）通過(guò)愈傷組織形成單倍體植株

細(xì)胞團(tuán)保持無(wú)序的分裂狀態(tài)，就會(huì)形成多細(xì)胞的愈傷組織，愈傷再經(jīng)過(guò)分化形成完整的植株。通過(guò)愈傷得到植株的倍性常不只是單倍體，也有二倍體，有時(shí)還有多倍體、混倍體等。形成原因：二倍體組織由單個(gè)花粉粒形成的細(xì)胞團(tuán)發(fā)生融合。42花藥培養(yǎng)再生植株形成的途徑4344花粉與花藥的培養(yǎng)456、花藥及花粉植物的倍性及染色體加倍

花粉植株的倍性－－復(fù)雜多變，影響因素也多。通過(guò)花藥、花粉培養(yǎng)獲得的植株，常常有單倍體、二倍體、三倍體、四倍體和非整倍體。再生植株的倍性鑒定:可用鏡檢檢查根尖染色體數(shù)目，或根據(jù)氣孔周圍保衛(wèi)細(xì)胞的大小以及細(xì)胞中葉綠體數(shù)目來(lái)初步鑒別。46染色體的加倍：

秋水仙素處理％)：浸泡、涂抹或滴液法；處理部位因植物種類不同而不同，如雙子葉植物多處理生長(zhǎng)點(diǎn)、頂芽、腋芽等部位。用秋水仙素處理，可在培養(yǎng)階段處理，也可在移栽后處理：培養(yǎng)階段處理，在培養(yǎng)基中加入50-250mg/L秋水仙素。移栽后處理，用0.2%秋水仙素涂抹或浸泡生長(zhǎng)點(diǎn)1-3天，或每日傍晚在生長(zhǎng)點(diǎn)處點(diǎn)滴數(shù)滴，連續(xù)進(jìn)行5-6天。47水稻單倍體植株的培育及加倍48愈傷組織加倍法：將單倍體的葉、莖、葉柄、和根等器官切成小塊后置于合適的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成愈傷組織，經(jīng)分化培養(yǎng)之后，能得到一定數(shù)量染色體加倍的植株。49花粉培養(yǎng)過(guò)程（油菜）50花粉培養(yǎng)及發(fā)育過(guò)程51白菜花粉分化不定芽52535455種子的結(jié)構(gòu)5657585960616263646566676869BACK遠(yuǎn)緣雜交培育雜種后代（白藍(lán)）子房種間雜交70A.雜交

根據(jù)育種目標(biāo)，選擇親本，人工授粉（包括：母本去雄、套袋、授粉）切斷花柱后在斷面進(jìn)行授粉－百合71727374白藍(lán)75梨和蘋果的雜種植株767778798081振蕩培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)82838485愈傷組織形態(tài)發(fā)生86取根尖、幼葉或愈傷組織0.2-0.5%秋水仙素堿溶液在25℃浸泡4-8h流水沖洗5-10min卡諾氏液或FAA液固定1M鹽酸，60℃水浴8-10min染色、壓片、鏡檢、計(jì)數(shù)874、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件88穩(wěn)定型：三倍體畸變型：除少數(shù)是三倍體，多數(shù)是由多種倍性細(xì)胞組成的嵌合體89909192培養(yǎng)基：White,Nitsch,MS93雌