提高腦組織冰凍切片質(zhì)量的幾點體會

提高腦組織冰凍切片質(zhì)量的幾點體會一、本文概述腦組織冰凍切片技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究的重要實驗手段，其質(zhì)量直接影響到后續(xù)的實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)分析。然而，由于腦組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和特殊性，冰凍切片過程中往往面臨著諸多挑戰(zhàn)，如切片厚薄不均、組織變形、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞等問題。本文旨在分享在腦組織冰凍切片實踐中積累的經(jīng)驗和體會，探討提高切片質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和操作技巧。通過對冰凍切片前處理、切片過程、切片后處理等關(guān)鍵步驟的詳細(xì)闡述，本文旨在為神經(jīng)科學(xué)研究者提供一套行之有效的腦組織冰凍切片方法，以期提高切片質(zhì)量，為后續(xù)實驗提供可靠的基礎(chǔ)。二、腦組織冰凍切片的基本原理和技術(shù)要點腦組織冰凍切片是一種在低溫條件下對腦組織進(jìn)行快速冷凍，然后進(jìn)行切片的技術(shù)。其基本原理是利用低溫使組織迅速固化，保持組織的原始結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，以便后續(xù)的觀察和分析。這一技術(shù)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究、病理學(xué)診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。技術(shù)要點方面，選擇合適的固定液對腦組織進(jìn)行固定是至關(guān)重要的。常用的固定液如4%的多聚甲醛可以有效地固定腦組織，保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定?？焖俣鶆虻睦鋬鲞^程也是關(guān)鍵。這通常通過使用液氮或冷凍機實現(xiàn)，以最大程度地減少冰晶形成對組織結(jié)構(gòu)的破壞。在切片過程中，選擇適當(dāng)?shù)那衅穸群蜏囟纫彩欠浅Ｖ匾?。一般來說，切片厚度在10-50微米之間，而切片溫度則需要在-20℃到-30℃之間。對切片進(jìn)行后處理，如染色、封片等，也是提高切片質(zhì)量的重要步驟。腦組織冰凍切片技術(shù)需要嚴(yán)格的操作流程和精確的控制，以確保切片的質(zhì)量和準(zhǔn)確性。通過不斷地優(yōu)化技術(shù)和積累經(jīng)驗，我們可以進(jìn)一步提高腦組織冰凍切片的質(zhì)量，為神經(jīng)科學(xué)研究和病理學(xué)診斷提供更可靠的支持。三、提高腦組織冰凍切片質(zhì)量的措施腦組織冰凍切片是神經(jīng)科學(xué)研究中的一項重要技術(shù)，其質(zhì)量直接影響到后續(xù)的實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)分析。為了提高腦組織冰凍切片的質(zhì)量，我們采取了一系列措施，并取得了顯著的成效。在取材過程中，我們嚴(yán)格控制取材時間，確保腦組織在死亡后盡快被取出并處理。同時，我們采用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汉凸潭〞r間，以保持腦組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。通過優(yōu)化取材與固定流程，我們減少了組織自溶和變形等問題的發(fā)生，為后續(xù)的切片工作奠定了良好的基礎(chǔ)。為了提高切片質(zhì)量，我們對冰凍切片設(shè)備進(jìn)行了升級和改造，如更換更鋒利的刀片、調(diào)整切片機的溫度和速度等。我們還采用了先進(jìn)的冰凍切片技術(shù)，如免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)等，以提高切片的分辨率和特異性。這些措施顯著提高了腦組織的切片質(zhì)量和染色效果。在切片過程中，我們嚴(yán)格控制切片的厚度和連續(xù)性，確保每個切片都能完整、清晰地展示腦組織的結(jié)構(gòu)。同時，我們還注意切片過程中的溫度和濕度控制，以防止組織變形和脫片。我們還定期對切片設(shè)備進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)，以確保其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。為了更清晰地展示腦組織的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分布，我們采用了多種染色方法，如HE染色、免疫組化染色等。在染色過程中，我們嚴(yán)格控制染色時間和濃度，確保染色均勻、一致。我們還采用了先進(jìn)的染色技術(shù)，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)等，以提高染色的特異性和靈敏度。我們注重實驗人員的培訓(xùn)與技能提升。通過定期舉辦培訓(xùn)班和研討會，我們不斷提高實驗人員的切片技術(shù)和染色水平。我們還鼓勵實驗人員之間的交流與合作，共同分享經(jīng)驗和技巧，以提高整個團隊的技術(shù)水平。通過優(yōu)化取材與固定流程、改進(jìn)冰凍切片設(shè)備與方法、加強切片過程中的質(zhì)量控制、提高染色技術(shù)與效果以及加強實驗人員的培訓(xùn)與技能提升等多項措施的綜合應(yīng)用，我們成功提高了腦組織冰凍切片的質(zhì)量。這些措施不僅為神經(jīng)科學(xué)研究提供了更加準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)支持，也為其他領(lǐng)域的生物醫(yī)學(xué)研究提供了有益的借鑒和參考。四、實驗結(jié)果與分析在本文的實驗過程中，我們對腦組織冰凍切片的質(zhì)量進(jìn)行了詳盡的研究和改進(jìn)。實驗采用了多種不同的切片方法和技術(shù)，以期找到最佳的實驗條件。通過對比實驗，我們發(fā)現(xiàn)，切片溫度、切片厚度、固定劑的種類和濃度等因素對冰凍切片質(zhì)量有著顯著的影響。我們發(fā)現(xiàn)切片溫度是影響冰凍切片質(zhì)量的關(guān)鍵因素。當(dāng)切片溫度過低時，組織容易出現(xiàn)冰晶，導(dǎo)致切片變形和結(jié)構(gòu)破壞；而溫度過高則可能導(dǎo)致組織融化，切片難以保持完整的形態(tài)。通過反復(fù)實驗，我們確定了最佳的切片溫度為-20℃至-25℃。切片厚度也是影響切片質(zhì)量的重要因素。過厚的切片不僅難以獲得清晰的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而且可能導(dǎo)致切片在染色過程中出現(xiàn)不均勻著色。反之，過薄的切片雖然可以獲得更清晰的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但可能使切片在染色過程中易于脫落。在我們的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)切片厚度為8-12μm時，切片質(zhì)量最佳。我們還研究了固定劑的種類和濃度對冰凍切片質(zhì)量的影響。通過對比不同種類的固定劑，我們發(fā)現(xiàn)使用4%的多聚甲醛作為固定劑可以獲得較好的切片效果。我們還發(fā)現(xiàn)固定劑的濃度過高或過低都可能影響切片的質(zhì)量。因此，我們確定了最佳的固定劑濃度為4%。通過對切片溫度、切片厚度、固定劑的種類和濃度等因素的研究和優(yōu)化，我們成功地提高了腦組織冰凍切片的質(zhì)量。這些實驗結(jié)果不僅為我們后續(xù)的研究提供了有力的技術(shù)支持，同時也為其他研究者提供了有價值的參考。五、結(jié)論與展望經(jīng)過對腦組織冰凍切片制作技術(shù)的深入研究和實踐，我們深刻認(rèn)識到，提高腦組織冰凍切片質(zhì)量的關(guān)鍵在于對切片制作流程的精細(xì)控制和對實驗條件的嚴(yán)格把控。通過優(yōu)化取材、固定、脫水、包埋、切片、染色等各個環(huán)節(jié)，我們顯著提升了腦組織的切片質(zhì)量和染色效果，為后續(xù)的腦組織形態(tài)學(xué)研究和疾病診斷提供了更為可靠的技術(shù)支持。盡管我們在腦組織冰凍切片制作技術(shù)方面取得了一定成果，但仍有許多方面值得進(jìn)一步探索和改進(jìn)。未來，我們將繼續(xù)優(yōu)化切片制作流程，探索更為高效的固定和染色方法，以提高腦組織的切片質(zhì)量和染色效果。我們也將關(guān)注新技術(shù)、新方法的發(fā)展，如免疫熒光雙標(biāo)、三維重構(gòu)等技術(shù)，以進(jìn)一步拓展腦組織形態(tài)學(xué)研究的深度和廣度。我們期望通過不斷努力，為腦組織疾病的研究和診斷提供更加精準(zhǔn)、高效的技術(shù)手段，為醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。參考資料：冰凍切片是病理科常用的一種技術(shù)，由于其操作簡便、快捷，是病理診斷中常用的一種制片技術(shù)，廣泛應(yīng)用于術(shù)中病理診斷及尸檢等。然而，腦組織因其特殊的組織結(jié)構(gòu)和組成，在冰凍切片制作過程中容易發(fā)生一些問題，影響病理診斷的準(zhǔn)確性。本文總結(jié)了在實際工作中遇到的一些問題，并提出了一些解決辦法，以提高腦組織冰凍切片的質(zhì)量。腦組織富含膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且含水量較高，因此在冰凍切片時容易發(fā)生破碎。由于腦組織的結(jié)構(gòu)特點，有時會出現(xiàn)切片不完整的情況，如切片的邊緣不整齊、切片厚度不均等。腦組織中的某些成分染色效果不佳，如神經(jīng)纖維和髓鞘等，導(dǎo)致染色后無法清晰地觀察組織結(jié)構(gòu)。選擇適當(dāng)?shù)那衅逗驼{(diào)整切片厚度是提高切片質(zhì)量的關(guān)鍵。對于腦組織，建議使用鋒利的單面刀片，并調(diào)整切片厚度為5～7μm。在切片前應(yīng)將刀片放置在冷凍臺上充分冷凍，以增加刀片的鋒利度和穩(wěn)定性。取材是制作切片的第一步，也是影響切片質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。取材時應(yīng)盡量選取病變較為典型、組織結(jié)構(gòu)完整的區(qū)域，避免選取壞死、出血等非典型區(qū)域。同時，要注意將組織塊放置在冷凍臺上時用力均勻，避免組織塊發(fā)生變形或移位。冷凍時間是影響冰凍切片質(zhì)量的重要因素之一。冷凍時間過短，組織塊未完全固定在切片機上，會導(dǎo)致切片破碎或卷曲；冷凍時間過長，則會導(dǎo)致組織過硬，不易切削。因此，在制作腦組織冰凍切片時，應(yīng)控制好冷凍時間，確保組織塊既能夠完全固定在切片機上，又不會過硬。一般而言，冷凍時間應(yīng)在20～30秒左右。染色是影響冰凍切片質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)之一。針對腦組織的特點，可以選擇適當(dāng)?shù)娜旧椒ㄒ蕴岣呷旧Ч?。如神?jīng)纖維和髓鞘等不易染色的成分，可以采用蘇木素-伊紅染色法（HE染色）進(jìn)行染色；對于需要特殊染色的病例，可以采用特殊染色法進(jìn)行染色。同時，要注意染色時應(yīng)嚴(yán)格按照染色程序進(jìn)行操作，以保證染色效果的一致性和準(zhǔn)確性。切片機和刀片是制作冰凍切片的必備工具，其狀態(tài)直接影響到切片質(zhì)量。因此，在日常工作中應(yīng)注意定期維護(hù)保養(yǎng)切片機和刀片。如定期檢查切片機的工作狀態(tài)、調(diào)整切片厚度等；定期更換刀片，以保證刀片的鋒利度和穩(wěn)定性；在使用過程中要注意避免碰撞和摔落等意外情況的發(fā)生。提高腦組織冰凍切片的質(zhì)量需要從多個方面入手，包括選用適當(dāng)?shù)墓ぞ?、注意取材技巧、控制好冷凍時間、選擇合適的染色方法以及定期維護(hù)保養(yǎng)切片機和刀片等。只有在實際工作中不斷總結(jié)經(jīng)驗、加強技術(shù)交流與合作、提高操作技能水平，才能更好地提高腦組織冰凍切片的質(zhì)量，為病理診斷提供更加準(zhǔn)確可靠的依據(jù)。在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究中，對動物組織進(jìn)行石蠟切片免疫組化染色是常見的實驗方法。這種技術(shù)能夠檢測組織中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)，有助于我們深入理解細(xì)胞和組織的生理和病理過程。在這里，我將分享我對大鼠腦組織石蠟切片免疫組化實驗的一些體會。實驗前的準(zhǔn)備是非常重要的。在實驗前，必須對實驗的目的、步驟和可能的結(jié)果有清晰的理解。還需要仔細(xì)選擇適當(dāng)?shù)目贵w，以確保能夠有效地檢測到目標(biāo)蛋白質(zhì)。同時，確保實驗室設(shè)備和試劑的質(zhì)量也是至關(guān)重要的，這可以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在實驗過程中，石蠟切片的制備是關(guān)鍵步驟之一。這一步驟需要精確控制溫度和時間，以確保切片的質(zhì)量。在免疫組化染色過程中，也需要精確控制反應(yīng)條件，包括抗體濃度、孵育時間和溫度等。為了避免非特異性染色，需要選擇適當(dāng)?shù)姆忾]血清，并對抗體進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尅Ｔ趯嶒灲Y(jié)束后，結(jié)果的解讀和分析也是非常重要的。需要仔細(xì)閱讀染色結(jié)果，并對其進(jìn)行分析。對于陰性結(jié)果，需要仔細(xì)分析原因，可能是由于抗體不匹配、抗原降解或?qū)嶒灢僮鞑划?dāng)?shù)?。對于陽性結(jié)果，需要仔細(xì)分析蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和強度，以得出正確的結(jié)論。大鼠腦組織石蠟切片免疫組化實驗是一項技術(shù)性很強的實驗。在實驗前、實驗中和實驗后都需要仔細(xì)的準(zhǔn)備和操作，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過不斷的實踐和經(jīng)驗積累，我們可以不斷提高自己的實驗技能和結(jié)果分析能力，為科學(xué)研究做出更好的貢獻(xiàn)。在手術(shù)臺上取下的組織放到冷凍機里面-20度左右凍成硬塊，制成切片用于快速診斷,該診斷僅作參考，應(yīng)以石蠟診斷為主。冰凍切片（frozensection）是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后進(jìn)行切片的方法。因其制作過程較石蠟切片快捷、簡便，而多應(yīng)用于手術(shù)中的快速病理診斷。冰凍切片的種類較多，有低溫恒冷箱冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，甲醇循環(huán)制冷冰凍切片法等。這些方法，隨著時代的變遷，科技的發(fā)展，許多年前被認(rèn)為是非常重要的技術(shù)，也逐步被淘汰了。當(dāng)然有些技術(shù)，如低溫恒冷箱冰凍切片法，正在受到重視。（1）在手術(shù)進(jìn)行中，突然發(fā)現(xiàn)病人的病變與原診斷，原定手術(shù)方案不相符合，或者懷疑時，需要病理確定。（2）了解淋巴結(jié)內(nèi)是否有轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，或者轉(zhuǎn)移的程度，以利于確定是否需要徹底掃除淋巴結(jié)或者其它的治療措施。（3）對于已確定為惡性腫瘤的患者，則需要了解其手術(shù)范圍是否足夠，上下切緣是否有殘存的腫瘤組織。（5）顯示組織中的脂肪和脂類物質(zhì)，這常見于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研組織等。（7）神經(jīng)病理學(xué)技術(shù)中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。病理檢查首先需要將切下的病變組織器官作一系列技術(shù)處理，包括固定、取材、脫水、浸蠟、包埋、切片和染色等，一般需花費24小時方可完成全部制片過程，然后由病理醫(yī)生用顯微鏡觀察，并做出診斷。這種檢查方法稱為常規(guī)石蠟切片，是病理檢查中最常用的方法。但是，這種方法從外科醫(yī)生將病變組織切下，到做出病理診斷，前后通常需要3天的時間。有時外科醫(yī)生希望在手術(shù)過程中馬上了解病變的性質(zhì)，以便及時確定手術(shù)范圍，并做出相應(yīng)的處理，就要求病理醫(yī)生在手術(shù)過程中做出病理診斷，此時就必須快速切片診斷，快速冰凍切片是應(yīng)用的最廣泛的方法。快速冰凍切片是用于手術(shù)中病理診斷的一種方法，病理醫(yī)生在收到手術(shù)標(biāo)本后約15分鐘之內(nèi)做出診斷，馬上電話告訴手術(shù)醫(yī)生，以便迅速作出下一步治療決策。病理診斷的正確與否直接關(guān)系到手術(shù)臺上處理患者的下一個步驟，如乳腺腫塊切除后的冰凍報告是良性的纖維腺瘤，則可宣告手術(shù)結(jié)束；如冰凍報告是乳腺癌，就需要進(jìn)一步擴大手術(shù)范圍，切除整個乳房及腋窩淋巴結(jié)；肢體的惡性腫瘤如骨肉瘤，通常需截肢。冰凍切片病理診斷對手術(shù)治療有重大幫助和指導(dǎo)意義，診斷要力求正確、迅速和可靠。然而，快速冰凍切片要在如此之短的時間內(nèi)做出診斷，難度相當(dāng)高，取材有局限性，制作切片的質(zhì)量也不如常規(guī)石蠟切片高。因此，冰凍切片的確診率比常規(guī)切片低，有一定的延遲診斷率和誤診率，所以冰凍切片診斷尚不能廣泛應(yīng)用，即使選擇性應(yīng)用，事后仍需用常規(guī)石蠟切片對照和存檔。⑤幫助識別手術(shù)中某些意外和確定可疑微小組織（如甲狀旁腺、輸卵管或輸精管等）；⑥取新鮮組織供激素受體測定、腫瘤藥敏試驗、電鏡檢查和分子生物學(xué)檢查等特殊需要。以ShandonAs620E型恒溫箱冷凍切片機為例，該機的箱面上有電子控制板，裝有即時冷凍鍵和除霜鍵，啟動即時冷凍鍵，機器馬上進(jìn)行工作狀態(tài)，并可持續(xù)10分鐘。啟動即時除霜鍵，可將工作間頂部后面的制冷柵上的霜除掉，并可持續(xù)15分鐘。有照明鍵一個，啟動該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。配有消毒鍵一個，當(dāng)進(jìn)行一周的工作或者一天的工作后，啟動該鍵，可對工作間進(jìn)行消毒。當(dāng)每天工作完畢時，可啟動密鎖鍵，鎖住工作間。除此之外，箱面的左邊有四個按鍵，兩個為快速自動進(jìn)退鍵，兩個為微小進(jìn)退鍵，還有一個手動旋鈕，調(diào)節(jié)修組織塊時的進(jìn)退。冷凍箱內(nèi)左邊的冷凍臺，溫度可達(dá)-60℃左右，冷凍箱的中間為一臺切片機，工作間的溫度在0-30℃間可任意調(diào)節(jié)，并在箱面上的熒屏顯示出來。①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。③將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。④調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。⑤調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?。切片時，切出的切片能在第一時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。⑥應(yīng)視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝組織和淋巴結(jié)時，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10--15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調(diào)在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時，應(yīng)調(diào)至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應(yīng)調(diào)至-30℃。①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。②多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺上凍起來，然后依據(jù)不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。③放置組織冰凍前，應(yīng)視組織的形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。④組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達(dá)到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預(yù)先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現(xiàn)冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經(jīng)固定前，其中的水分也可滲入到組織中去，當(dāng)冰凍發(fā)生時，這些水分就存留于組織中，形成了冰晶。⑤當(dāng)切片時，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點。⑥用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當(dāng)附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當(dāng)它們碰撞在一起時，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發(fā)生上述的現(xiàn)象。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分鐘后即可染色。以往，為了防止切片脫落，當(dāng)切片附貼于載玻片后，即用電吹風(fēng)吹干后再固定。根據(jù)實驗對比認(rèn)為這種做法欠妥未經(jīng)固定的切片，強熱作用后，蛋白發(fā)生變性，核內(nèi)含有的物質(zhì)由于熱的作用融合在一起，染色后鏡下分辨不出核內(nèi)的各種物質(zhì)。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)都在沒有任何變化的情況下被固定起來，核染色質(zhì)清晰，核仁明顯，其他物質(zhì)都完好保存。冰凍組織1－2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分鐘?？偣苍?0分鐘內(nèi)完成快速制片過程，結(jié)果與石蠟切片不相上下。冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環(huán)的半導(dǎo)體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導(dǎo)體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法已很少使用，因此在這里不作闡述。1．簡便，可以不需要對組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進(jìn)行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)。5．能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對于那些對有機溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細(xì)胞膜表面抗原和水解酶保存較好。2．切取的組織不能過大，組織過大不容易凍結(jié)或者組織凍結(jié)不均，影響切片及染色效果。4．組織塊在凍結(jié)過程中容易產(chǎn)生水的結(jié)晶而影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)的定位，并且組織結(jié)構(gòu)也不如石蠟切片清晰。組織盡可能新鮮、驟冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的驟冷劑有：①CO2氣（－78℃）②丙酮干冰冷卻的輕石油醚、乙烷和庚烷（－80℃）③液氮（－190℃）④液氮冷卻的丙烷（－19℃）。液氮適用于組織化學(xué)，較安全。缺點：組織塊易發(fā)生龜裂。為防止水解酶和其他物質(zhì)的移位、彌散，常用4℃、24小時的甲醛固定能很好地保存酶類。但對許多脫氫酶和轉(zhuǎn)移酶能滅活。故不宜使用，低溫，冷甲醛短時間固定（10分鐘左右）固定，可顯示琥珀酸脫氫酶。電鏡出現(xiàn)后，需要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，以4%緩沖戊二醛（25%戊二醛16ml；1M二甲胂酸（pH7．）84ml；蔗糖8g）固定較好。這些固定液主要用于水解酶，而不適于許多氧化還原酶和轉(zhuǎn)移酶。一般在冷凍后10分鐘，到接近冷室溫度時再切，一般組織在－15～－20℃切片最易成功。每種組織有其合適的切片溫度、刀的溫度和冷室溫度，Pearse及Bancroft的經(jīng)驗如下：抗卷板的前緣與刀面須有足夠的距離，使切片平滑通過?？咕戆迓愿哂诘睹娴淖罡唿c?？蓱{經(jīng)驗調(diào)整刀對組織的角度，一般新刀為20゜。操作程序：先接通電源，調(diào)定恒冷箱溫度，調(diào)整切片刀的角度，調(diào)定切片厚度，標(biāo)本置載臺致冷達(dá)所需溫度后，將其安放在切片機推進(jìn)器上。即可切片。恒冷箱視使用情況每周或每月清潔一次冰霜。新刀切片滿意，舊刀用自動磨刀機磨刀較好。如果切片刀與抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把銳利的刀，就能獲得理想的切片。小塊組織驟冷→立即在真空干燥脫水（－30～－40℃）冰升華，水氣去除，不會發(fā)生酶的彌散→材料干后，升到室溫浸于石蠟或碳蠟包埋。能出色地保存組織的酶活性，還有助于保持組織的結(jié)構(gòu)。但儀器貴，需時長。組織塊驟冷→組織內(nèi)的水，在低溫（－40℃～－70℃）液體脫水劑中被替代（醇、丙酮），同時起到固定作用→脫水組織漸恢復(fù)到室溫，用石蠟包埋。冰凍切片是較難掌握的病理實驗技術(shù)之一，要做好一張冰凍切片絕不能只求速度，否則常適得其反。為了不漏診、誤診，及時準(zhǔn)確地作出診斷，確保結(jié)果科學(xué)性、正確性、真實性，這就需要醫(yī)護(hù)人員在進(jìn)行冰凍切片時應(yīng)有嚴(yán)格的責(zé)任心、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度、密切聯(lián)系臨床、豐富的工作實踐經(jīng)驗，不斷