T-SHRH 021-2019 化妝品美白功效測(cè)試 體外重組3D黑色素模型 測(cè)試方法

71.100.70C2682Y42

T/SHRH

021-2019________________________________________________________________________________________化妝品美白功效測(cè)試

3D

In

Reconstructed

skin

test

T/SHRH

021-2019 前言…………… 21

32.

規(guī)范性引用文件………… 33.

術(shù)語(yǔ)和定義……………… 34.

試驗(yàn)原則…………………. 35.

試劑及儀器設(shè)備………… 46.

試驗(yàn)步驟………………… 47.

結(jié)果計(jì)算………………… 58.

質(zhì)量控制………………… 69.

結(jié)果判定………………… 6附錄

（資料性附錄）………………………

7T/SHRH

021-2019 本標(biāo)準(zhǔn)按照

GB/T1.1-2009

給出規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)提出和歸口。本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利，本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。公司、上海創(chuàng)元化妝品有限公司、福建片仔癀化妝品有限公司、東阿阿膠股份有限公司、上海綠瑞生物科技有限公司、云南貝泰妮生物科技集團(tuán)股份有限公司、上海清軒生物科技有限公司、上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司、上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：

盧永波、李瀟、張艷云、曹平、陳田、陳靜、廖箏箏、曾四立、吳梅芳、陳貞明、謝阿貴、廖峰

、姜春鵬、趙奕竹、馬驍、王飛飛、高宏旗、朱翠翠、李瓊、金堅(jiān)、陳亦華T/SHRH

021-2019化妝品美白功效測(cè)試

體外重組

黑色素模型測(cè)試方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了一種基于體外重組本標(biāo)準(zhǔn)適用于具有生物化學(xué)美白作用的化妝品原料及成品的美白功效測(cè)試，不適用于物理遮蓋類(lèi)美白原料或成品。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法化妝品安全技術(shù)規(guī)范3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1

體外重組

黑色素皮膚模型

reconstructed

skin

containing

采用人原代表皮角質(zhì)形成細(xì)胞及黑素細(xì)胞共培養(yǎng)形成的一種復(fù)層化、高度分化的三維重建皮膚模UVB、α、

白響應(yīng)。3.2

吸光度

optical

OD入射光強(qiáng)度與透射光強(qiáng)度比值的常用對(duì)數(shù)值。表示被檢測(cè)物吸收的光學(xué)密度。特定波長(zhǎng)下，同一種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能量成正比關(guān)系。4 試驗(yàn)原則4.1 方法簡(jiǎn)要步驟本標(biāo)準(zhǔn)采用體外重組

?進(jìn)行美白功效性測(cè)試?；瘖y品原料采用液下給藥方式，在氣液面培養(yǎng)的第

6

天（續(xù)給藥

6

6

第

8

2

次，單次給藥后孵育時(shí)長(zhǎng)為

結(jié)束后，去除待測(cè)物殘留，對(duì)暴露后的體外重組

黑色素模型進(jìn)行表觀色度，值，黑色素分布及黑素含量等測(cè)試。4.2 方法測(cè)試終點(diǎn)生物化學(xué)美白主要通過(guò)抑制黑色素的合成、阻斷黑色素的轉(zhuǎn)運(yùn)及加快黑色素的代謝等機(jī)制達(dá)到美

?T/SHRH

021-2019

值用于測(cè)定待測(cè)物的亮白作用；黑素顆粒分布用于測(cè)定待測(cè)物的黑素轉(zhuǎn)運(yùn)抑制作用；黑素含量用于測(cè)定待測(cè)物的黑素合成抑制作用。5 試劑及儀器設(shè)備5.1

材料及試劑5.1.1

黑色素皮膚模型（?）。5.1.2

體外重組

黑色素皮膚模型培養(yǎng)液（

培養(yǎng)液）。5.1.3

PBS

緩沖液。5.1.4

曲酸（Acid，）。5.1.5

，DMSO5.1.6

乙醇。5.1.7

乙醚。5.1.8

氫氧化鈉（NaOH5.1.9

丙二醇。5.1.10

號(hào)：）。

多聚甲醛（4%5.1.12

黑色素染色試劑盒。5.2 儀器設(shè)備5.2.1

。5.2.2 酶標(biāo)儀：405nm。5.2.3 超凈工作臺(tái)。5.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)箱：℃±1℃，5±，相對(duì)濕度。5.2.5 分析天平(精度

。5.2.6

活塞排代式移液器和相應(yīng)吸頭、2μL~10μL、

100μL、20~200μL、100~1000μL

移液器及相應(yīng)吸頭。5.2.7 通風(fēng)柜。5.2.8 電熱恒溫水浴鍋（℃）。5.2.9 單反相機(jī)。5.2.10

色度儀。

正置顯微鏡。5.2.12

低溫高速離心機(jī)。6 試驗(yàn)步驟6.1

體外重組

3D

黑色素皮膚模型的準(zhǔn)備該步驟在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。每輪測(cè)試中，空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和各待測(cè)物組均需要

1

塊

6

6

mL

的

面培養(yǎng)

3

天（）的體外重組

黑色素皮膚模型轉(zhuǎn)移至無(wú)菌懸架中，置于

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（±15±1%

CO、95%

6

3

個(gè)重復(fù)模型；值、黑素含量測(cè)定需

3

個(gè)重復(fù)模型。6.2

UVB

誘導(dǎo)T/SHRH

021-20197天UVB50mJ/cm/次。每次輻照結(jié)束后，更換培養(yǎng)液，液量為

3.7

孔?？瞻讓?duì)照組不進(jìn)行

養(yǎng)液，液量為

孔。6.3

給藥6.3.1

化妝品成品給藥方式在氣液面第

6

天（）和氣液面第

8

天（）進(jìn)行表面給藥，給藥量為

10μL。陽(yáng)性對(duì)照選用曲酸，給藥濃度為

0.05%。6.3.2

化妝品原料給藥方式從氣液面第

6

6

24h添加含

42.67μg

曲酸的

照組、空白對(duì)照組僅更換培養(yǎng)液。6.4

清洗：化妝品成品給藥全部結(jié)束后，采用超純水對(duì)皮膚模型表面清洗三次，去除受試物殘留?；瘖y品原料類(lèi)給藥全部結(jié)束后，用無(wú)菌棉簽擦拭皮膚模型底面，去除受試物殘留。6.5

檢測(cè)6.5.1

表觀色度將比色卡置于單反相機(jī)正下方，用鑷子將單個(gè)模型放置于比色卡色圈內(nèi)，進(jìn)行拍照。單反相機(jī)參數(shù)設(shè)置為手動(dòng)拍照模式，焦距調(diào)至

，孔徑設(shè)置為

，光圈調(diào)至

，快門(mén)速度設(shè)置為

1/80s，

設(shè)置為

1600。6.5.2

L*值測(cè)定用手術(shù)刀片沿模型邊緣進(jìn)行環(huán)切后，用干凈的鑷子置于相片紙上，保證角質(zhì)層朝上放置；色差儀

值最終讀數(shù)。6.5.4

黑素顆粒分布測(cè)定將表觀色度拍照結(jié)束后的模型，用手術(shù)刀片沿模型邊緣進(jìn)行環(huán)切后，放入裝有

4%多聚甲醛溶液的

2h

5~8μm

置于正置顯微鏡下

倍物鏡下拍照，觀察黑素顆粒分布。6.5.3

黑色素含量檢測(cè)將

值測(cè)定后的模型置于

1.5mL

PBS

高速離心機(jī)

離心

，棄上清；向

離心管中依次加入

蒸餾水，500μL

無(wú)水乙醇和

500μL

，

離心

含10%DMSO

的

NaOH

80℃水浴中加熱

，用移液器吸取

200μL

至

96

孔板中，酶標(biāo)儀

405nm

波長(zhǎng)下讀取

OD

值。7 結(jié)果計(jì)算T/SHRH

021-20197.1 值根據(jù)每組三個(gè)重復(fù)模型的

值，計(jì)算平均值（Mean）及標(biāo)準(zhǔn)差（

，），結(jié)果采用

Mean±

形式表示。7.2

黑素含量以黑色素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD

值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程式，將測(cè)定的OD

值代入回歸方程式，計(jì)算黑素含量。計(jì)算每組三個(gè)重復(fù)模型的黑素含量平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果采用

Mean±

形式表示。7.3

黑素顆粒分布每個(gè)模型選

3

J

8 質(zhì)量控制8.1

基本原則：每批次試驗(yàn)均需設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的各種對(duì)照應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)。如任一種對(duì)照出現(xiàn)非下述標(biāo)準(zhǔn)，則視為質(zhì)控不合格。8.2

陰性對(duì)照：與空白對(duì)照組相比，表觀色度呈現(xiàn)明顯黑化，值呈現(xiàn)

10%以上下降，黑素含量呈現(xiàn)10%

值與黑素含量標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于等于

。8.3

陽(yáng)性對(duì)照：與陰性對(duì)照組相比，表觀色度呈現(xiàn)明顯變白，值呈現(xiàn)

10%以上升高，黑素含量呈現(xiàn)10%

值與黑素含量標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于等于

。8.4

待測(cè)樣品：三個(gè)重復(fù)模型的

值與黑素含量標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于等于

。9

結(jié)果判定以下條件說(shuō)明待測(cè)物具有美白功效:與陰性對(duì)照組相比，待測(cè)物表觀色度明顯變白，值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異；與陰性對(duì)照組相比，待測(cè)物黑色素顆粒分布減少，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異