多糖分離及結(jié)構(gòu)研究樣本

多糖分離純化基本原則和辦法多聚糖(polysaccharide)，簡稱多糖，常由一百個以上甚至幾千個單糖基通過糖苷鍵連接而成，其性質(zhì)已大不同于單糖，如甜味和強還原性已經(jīng)消失，廣泛存在于動物細(xì)胞膜和植物、微生物細(xì)胞壁中，是構(gòu)成生命四大基本物質(zhì)之一，與生命功能維持密切有關(guān)。近年來，大量研究表白多糖除了有增強免疫功能、抗腫瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系統(tǒng)保護作用生物學(xué)效應(yīng)外，尚有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗輻射、抗凝血等作用。

1、基本原則

在不破壞多糖活性前提下進行多糖分離純化。盡量不引入新雜質(zhì)，或引入新雜質(zhì)易于除去，如小分子鹽類可通過透析作用除去，銨根離子可通過加熱揮發(fā)除去等[1]。

2、分離純化辦法

多糖生物活性倍受關(guān)注，但不少多糖提取辦法和工藝尚未成熟，基于效率、成本多方面考慮，各種辦法開發(fā)、比較、分析是研究工作焦點之一。當(dāng)前多糖提取辦法重要有溶劑提取法、酸提法、堿提法、酶解法、超濾法、超聲法、微波法、超臨界流體萃取法。一方面要依照多糖存在形式及提取部位不同，決定在提取之前與否做預(yù)解決：提取時需注意對某些含脂較高根、莖、葉、花、果及種子類，在用水提取前，應(yīng)先加入甲醇或l：l乙醇乙醚混合溶液或石油醚進行脫脂，而對含色素較高根、莖、葉、果實類，需進行脫色解決。

2.1多糖提取與分離辦法

由于各類多糖性質(zhì)及來源不同，因此提取辦法也各有所異，重要歸納為如下幾類：

第一類

難溶于水，可溶于稀堿液重要是膠類，如木聚糖及半乳糖等。原料粉碎后用0.5mol/L

NaOH水溶液提取，提取液經(jīng)中和及濃縮等環(huán)節(jié)，最后加入乙醇，即得粗糖沉淀物。

第二類

易溶于溫水，難溶于冷水多糖，可用70~80℃熱水提取，提取液用氯仿：正丁醇（4:1）混合除去蛋白質(zhì)，經(jīng)透析、濃縮后再加入乙醇即得粗多糖產(chǎn)物[2]。

第三類

粘多糖提取。在組織中，粘多糖與蛋白質(zhì)以共價鍵結(jié)合，故提取時需設(shè)法破壞粘多糖與蛋白質(zhì)之間結(jié)合鍵。普通使用蛋白酶水解蛋白某些或堿解決，使粘多糖與蛋白質(zhì)之間結(jié)合鍵斷裂，以增進粘多糖釋放以便于提取[3]。（1）堿液提取法：本法重要根據(jù)是蛋白聚糖糖肽鍵對堿不穩(wěn)定。原料經(jīng)預(yù)解決后用0.5mol/LNaOH溶液4℃提取，提取液用酸中和。蛋白質(zhì)可用調(diào)pH、加熱、或用白陶土吸附法除去。最后以乙醇沉淀即可獲得成品。從軟骨中提取軟骨素即用此法。（2）蛋白水解酶消化法：從組織中釋放出粘多糖辦法，經(jīng)常使用是蛋白水解酶進行消化。普通應(yīng)用專一性低蛋白酶如木瓜蛋白酶及鏈霉素以進行廣泛蛋白質(zhì)水解。經(jīng)酶消化后提取液中重要尚有低分子量得蛋白消化產(chǎn)物及殘存蛋白等雜質(zhì)。蛋白質(zhì)可用5%三氯醋酸沉淀去除，小分子雜質(zhì)可用透析法去除。最后加入乙醇可得粘多糖沉淀。2.2多糖除雜質(zhì)蛋白質(zhì)去除，通過水提所獲得粗多糖常具有較多蛋白質(zhì)。采用醇沉或其他溶劑沉淀得到粗多糖中常具有較多蛋白質(zhì)，需要除蛋白。除蛋白辦法老式上有sevage法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等。三氯乙酸法去除蛋白率高，但多糖在三氯乙酸中不穩(wěn)定，糖苷鍵易斷裂，故多糖損失率也較高。鞣酸法蛋白去除率較低，但是此種辦法是運用鞣酸與蛋白質(zhì)特異性反映，不會導(dǎo)致多糖損失。Sevag法蛋白去除率最高,但是由于此法使用試劑是氯仿和正丁醇,而氯仿是有毒物質(zhì),容易導(dǎo)致多糖活性下降和溶劑殘留。此外，有機溶劑與去蛋白酶結(jié)合除蛋白法也常被用在實驗研究中，其效率更高，更加節(jié)約試劑和資金。為了避免使用有機溶劑可采用重復(fù)凍融辦法除蛋白。色素去除，植物多糖提取物中具有酚類化合物,在多糖提取過程中由于氧化作用會有色素生成，色素存在會影響多糖色譜分析和性質(zhì)測定。慣用脫色辦法有：吸附法(DE．AE纖維素、硅藻土、活性炭等)、氧化法(過氧化氫)、離子互換法。除小分子雜質(zhì)，小分子雜質(zhì)如低聚寡糖殘留往往影響多糖生物活性，需要進一步脫除，提高純度。老式辦法是透析法，該法操作簡樸、技術(shù)成熟，但周期長，往往需要2d-3d，常溫下操作有也許導(dǎo)致多糖霉變，必要時需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進行。隨著膜分離技術(shù)發(fā)展，纖維濾器透析法已經(jīng)發(fā)展起來了，它運用不同孔徑膜使大小不同分子分級，這種方式可縮短生產(chǎn)周期，并且條件溫和，無疑是多糖脫除雜質(zhì)一條新途徑。2.3多糖純化辦法多糖純化辦法諸多，須依照條件恰當(dāng)選取。必要時可使用各種辦法以達到抱負(fù)分離成果1.分級沉淀法用乙醇進行分級分離是分離多糖混合物典型辦法，并且合用于大規(guī)模分離。該法往往需要多次重復(fù)進行才干達到較好效果。如從肝素生產(chǎn)廢棄物中分離純化硫酸皮膚素[4]。分級沉淀有機試劑篩選有機試劑沉淀法作為純化生物大分子物質(zhì)一種典型辦法，選取有機溶劑時應(yīng)能和水混溶，使用較多有機溶劑如乙醇、丙醇、丙酮等，為避免生物活性大分子變性失活，沉淀應(yīng)在低溫下進行。分別選用乙醇、丙醇和丙酮作為沉淀劑，取預(yù)解決后樣品按固液比1∶10溶解于去離子水中，加入0.1V體積沉淀劑，搖勻20min，4℃密封靜置24h。離心1r/min，20min，4℃，取出沉淀并用20mL去離子水沖洗、凍干。再向上清液中加入0.1V原溶液體積沉淀劑，重復(fù)上述操作，直至加入沉淀劑時持續(xù)5次無沉淀產(chǎn)生。取各次沉淀溶解后進行醋酸纖維素薄膜電泳檢測。2.季銨鹽絡(luò)合法粘多糖聚陰離子與某些表面活性物質(zhì)，如十六烷基三甲基溴化銨中季銨基陽離子結(jié)合生成季銨絡(luò)合物。這些絡(luò)合物在低離子強度水溶液中不溶解。當(dāng)離子強度增大時，這些絡(luò)合物可以解離并溶解。本法長處是既合用于實驗室又合用于生產(chǎn)。季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉淀，慣用于酸性多糖分離。當(dāng)溶液pH值增高或加入硼砂緩沖液使糖酸度增高，也會與中性多糖形成沉淀。慣用季銨溴化物(cetyltri．methylammoniumbmmide，cTAB)及其氫氧化物(cetyltmethylamm0niumhydr(Jxiode，CTA一0H)和(certylpyridiumhydroxide，CP一0H)，其濃度普通為1％～10％(W／V)，它們可在酸性、中性、微堿性和堿性中分級沉淀分離出酸性多糖。3.柱層析法3.1凝膠柱層析法：慣用凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)，以不同濃度鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，使各種多糖得以分離純化，但不適當(dāng)粘多糖分離。3.2離子互換層析慣用互換劑為DEAE-纖維素、DEAE-葡萄糖凝膠(DEAE—Sephadex)、DEAE-瓊脂糖凝膠(DEAE-Sepharose)，此法合用于分離各種酸性、中性多糖和粘多糖。最慣用是DEAE-纖維素在pH為6時酸性多糖吸附于互換劑上，中性多糖不吸附，然后用逐漸提高鹽濃度洗脫液進行洗脫進而達到分離。它一方面可純化多糖，另一方面還可分離各種多糖。如川芎多糖分離純化[5]：纖維素柱水平衡后，取200mg粗多糖樣品溶解于蒸餾水中上樣，蒸餾水洗脫70ml后，以0～3mol/lNaCl溶液梯度洗脫，流速1.0ml/min，每管收集2ml，硫酸－苯酚法顯色檢測。凝膠柱層析和離子互換層析往往在分離純化過程中交替使用，以達到更好分離純化效果。如灰樹花多糖GFP75-2-2B[6]分離：4.超濾法采用中空纖維超濾膜，對多糖去蛋白質(zhì)后提取液通過超濾去除小分子雜質(zhì)5.色譜法色譜法是慣用純化多糖辦法，涉及離子互換色譜和凝膠色譜，色譜法是運用填料對不同種類糖吸附作用差別，使混合物中各糖分達到彼此分離辦法。逆流色譜（Countercurrentchromatography，CCC）技術(shù)是一種無固體載體持續(xù)液—液分派色譜技術(shù)，其固定相通過重力場和離心力場作用被保存在分離柱內(nèi)，流動相與固定相在色譜儀內(nèi)進行分派，而達到物質(zhì)分離。逆流色譜與老式色譜相比具備無死吸附、進樣量大、分離純度高等明顯優(yōu)勢，在食品、生物化工、制藥等領(lǐng)域具備遼闊應(yīng)用前景。在海帶多糖[7]分離純化中使用了該技術(shù)。用泵把固定相從進口注入HSCCC分離柱中，待固定相布滿后，開動主機，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速達到預(yù)定轉(zhuǎn)速并穩(wěn)定后，用20ml固定相溶解0.15g精制多糖，用恒流泵將樣品溶液以一定流速注入HSCCC，某些收集器收集。分離完畢后，停止轉(zhuǎn)動。用氣泵使HSCCC中液體流出。使用了逆流色譜分離多糖雙水相系統(tǒng)，在PEG1000濃度為12%，KH2PO4濃度為8%，K2HPO4濃度為8%，轉(zhuǎn)速在400r/min時，可以使海帶多糖達到較好分離。下圖為逆流色譜儀示意圖。6.制備性區(qū)帶電泳依照各種多糖分子大小，形狀及其所帶電荷不同可用電泳法進行分離。7.固定化凝集素親和層析法近年來依照凝集素能專一地、可逆地與游離和復(fù)合糖中單糖和寡糖結(jié)合性質(zhì)，運用固定化凝集素親和層析作為分離純化糖蛋白辦法。這一辦法簡樸易行，在溫和條件下進行不破壞糖蛋白活性。固定化刀豆凝集素（concanavalinA，ConA）是應(yīng)用最普遍固定化凝集素。ConA能專一地與甘露糖基結(jié)合，各種酶如α-和β-半乳糖苷酶、過氧化氫酶、干擾素等都可用固定化ConA純化。8.膜分離法膜分離具備無相變及化學(xué)變化、可常溫操作、選取性高與能耗低等長處。如馬尾藻多糖就采用了膜分離純化技術(shù)。海藻多糖是一類構(gòu)成相稱復(fù)雜生物大分子，使用膜分離技術(shù)對海藻多糖[8]進行分級可達到初步純化目。在壓力0．5MPa，溫度20℃條件下，將脫蛋白之后提取液稀釋至1L，先用孔徑0．1μm微濾膜過濾，提成濃縮液和透過液，將透過液依次用截留分子量為100、50、10、3kD超濾膜進行超濾，分別收集濃縮液和透過液。近20年來，由于分子生物學(xué)發(fā)展，人們逐漸結(jié)識到糖及其復(fù)合物分子具備極其重要生物功能，迅速高效、節(jié)約能源、簡便易行提取與純化工藝對多糖研究有重要意義。多糖在自然界植物中廣泛存在，但由于其種類多樣性、構(gòu)造構(gòu)成復(fù)雜性以及多糖分子量大、極性大等特點，給植物多糖提取、分離帶來很大困難，要想獲得較高多糖提取率，用單一提取辦法不一定能獲得抱負(fù)效果，將2種或者各種提取辦法結(jié)合也許得較好提取效果[9]。在多糖分離、純化中慣用分級沉淀法、纖維素柱色譜法和凝膠色譜法相結(jié)合辦法進行分離、純化，使多糖分離、純化能達到抱負(fù)效果。當(dāng)前較為慣用提取與純化技術(shù)比較成熟，但存在溶劑、能源消耗大且效率不高問題，合理使用某些新技術(shù)可以有效改進提取與純化效果，使多糖制備向高效節(jié)能方向發(fā)展；不斷摸索和完善提取與純化技術(shù)，將會使多糖制備向綠色、當(dāng)代化方向發(fā)展。多糖提取分離純化辦法在不斷更新，在選用辦法時，應(yīng)當(dāng)關(guān)注目的多糖性質(zhì)、特點，綜合比較進行實驗，才干選用最佳辦法和工藝。參照文獻[1]YuanfengWang,LanYu1,JiachenZhang,etal.Studyonthepurificationandcharacterizationofapolysaccharideconjugatefromteaflowers.[J]InternationalJournalofBiologicalMacromolecules.47()266–270.[2]JinweiLi,LiupingFan,ShaodongDing.Isolation，purificationandstructureofanewwater-solublepolysaccharidefromZizyphusjujubacv.Jinsixiaozao.[J]CarbohydratePolymers.83()477–482.[3]LiyanZhao,YanhongDong,GuitangChen,etal.Extraction，purification，characterizationandantitumoractivityofpolysaccharidesfromGanodermalucidum.[J]CarbohydratePolymers.80()783–789.[4]GuoRui1,CAOYan－ping2,SHIYu1,CAOYang,etal.Purifyingdermatansulfatefromthewasteinheparinproduction.[J]ScienceandTechnologyofFoodIndustry.1002－0306()03－0224－06.[5]SunXiao-chun,YANJun,HEGang,etal.PurificationandAnalysisofMonosaccharideCompositionofLigusticumchuanxiongpolysaccharide.[J]JournalofSichuanAgriculturalUniversity.1000-2650-()01-0056-05.[6]QiaoYanru1,LUOYonghuang,ZHOUShuai,etal.IsolationandPurificationofGFP75-2-2B,aPolysaccharidefromGrifolafrondosaFruitBodies，anditsEffectonNitricOxideReleasefromMacrophages.[J]JournalofAgriculturalSciences..17(4):48-51.[7]SongGuang-lei,DUQi-zhen.Studyonseparationandpurificationofkelppolysaccharidebyusingcountercurrentchromatographyandultrafiltrationgradeseparationmethod.[J]ScienceandTechnologyofFoodIndustry.1002-0306()02-0265-005.[8]YeHong,ZHOUChun－h(huán)ong,ZENGXiao－xiong.SeparationofPolysaccharidesfromSargassumpallidumbyMembraneTechnology.[J]HubeiAgriculturalSciences.0439－8114()02－0375-03.[9]ShuRen-geng,JIANGYue-ping,CAIYong-hong,etal.ExplorationofExtractionandIsolationMethodofPlantPolysaccharides.[J]ChinaPharmacy.1001-0408()11-1052-04.[10]吳梧桐《生物化學(xué)》第六版

多糖純化：

a、分部沉淀法：依照各種多糖在不同濃度低檔醇或丙酮中具備不同溶解度性質(zhì)，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出沉淀，經(jīng)重復(fù)溶解與沉淀后，直到測得物理常數(shù)恒定（最慣用是比旋光度測定或電泳檢查）。這種辦法適合于分離各種溶解度相差較大多糖。為了多糖穩(wěn)定，常在pH7進行，唯酸性多糖在pH7時－COOH是以－COO`離子形式存在，需在pH2－4進行分離，為了防止苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖制成各種衍生物如甲醚化物、乙?；锏?，然后將多糖衍生物溶于醇中，最后加入乙醚等極性更小溶劑進行分級沉淀分離。

b、鹽析法：在天然產(chǎn)物水提液中，加入無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度減少沉淀析出，與其他水溶性較大雜質(zhì)分離。常做鹽析無機鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。

c、季銨鹽沉淀法：季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉淀，慣用于酸性多糖分離。普通季胺鹽及其氫氧化物并不與中性多糖產(chǎn)生沉淀，但當(dāng)溶液PH增高或加入硼砂緩沖液使糖酸度增高時，也會與中性多糖形成沉淀。慣用季銨鹽有十六烷基三甲胺溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyltrimethylammoniumhydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinmhydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH濃度普通為1％－10％（W/V）多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉淀出來，因此控制季銨鹽濃度也能分離各種不同酸性多糖。值得注意是酸性多糖混合物溶液PH要不大于9，并且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉淀出來

d、柱層析：

纖維素柱層析：纖維素柱層析對多糖分離既有吸附色譜性質(zhì)，又具備分派色譜性質(zhì)，所用洗脫劑是水和不同濃度乙醇水溶液，流出柱先后順序普通是水溶性大先出柱，水溶性差最后出柱，與分級沉淀法正好相反。

纖維素陰離子互換柱層析：最常用互換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或堿型），洗脫劑可用不同濃度堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此辦法當(dāng)前最為慣用。它一方面可純化多糖，另一方面還適于分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。

凝膠柱層析：凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，慣用凝膠有葡聚糖凝膠（sephadexG）、瓊脂糖凝膠（sepharosebio－gelA）、聚丙烯酰胺凝膠（bio－gelP）等，慣用洗脫劑是各種濃度鹽溶液及緩沖液，但它們離子強度最佳不低于0.02。出柱順序是大分子先出柱，小分子后出柱。由于糖分子與凝膠間互相作用，洗脫液體積與蛋白質(zhì)分離有很大差別。在多糖分離時，普通是用孔隙小凝膠如sephadexG－25、G－50等先脫去多糖中無機鹽及小分子化合物，然后再用孔隙大凝膠sephadexG－200等進行分離。凝膠柱層析法不適合于粘多糖分離。柱層析原理:

柱層析法分離原理是依照物質(zhì)在硅膠上吸附力不同而使各組分分離。普通狀況下極性較大物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱物質(zhì)不易被硅膠吸附。當(dāng)采用溶劑洗脫時，發(fā)生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸過程，吸附力較強組分，移動距離小，后出柱；吸附力較弱組分，移動距離大，先出柱。

硅膠柱層析流動相：

極性小用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)；極性較大用甲醇：氯仿系統(tǒng)；極性大用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸

普通都是運用極性相似相容原理，看流動相與固定相極性，大某些是固定相極性不大于流動相，然后流動相極性與所要洗脫物質(zhì)極性比較接近，從而將物質(zhì)洗脫下來。一級構(gòu)造：單糖構(gòu)成、糖苷鍵類型：搞碘酸鹽氧化、Smith降解、甲基化

二級構(gòu)造：側(cè)鏈類型、位置

三級構(gòu)造：空間構(gòu)造：剛果紅顯色掃描，X-晶體衍射分析

并且每一步都要以紅外光譜、C-13核磁共振譜作跟蹤一級構(gòu)造要弄清晰主側(cè)鏈單糖構(gòu)成、糖基數(shù)量、糖苷鍵類型，從而擬定重復(fù)單位構(gòu)造。重要通過酸水解后GC分析擬定單糖構(gòu)成、HPLC（TSK柱）或凝膠色譜法測分子量以擬定糖基數(shù)量，某些酸水解、高碘酸鹽氧化、Smith降解、甲基化分析、核磁共振，共同擬定主側(cè)鏈糖苷鍵類型、位置。

發(fā)點自己在多糖構(gòu)造解析一點心得，和人們共同討論

食（藥）菌多糖構(gòu)造分析辦法普通來說可以分為兩大類：一類是老式化學(xué)辦法，一類是波譜學(xué)辦法。

2.1化學(xué)辦法

化學(xué)辦法是用來對某些簡樸單糖、二糖和寡糖進行分析典型辦法，同步亦可應(yīng)用在多糖構(gòu)造解析上。它是通過完全酸水解、某些酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析和氣質(zhì)聯(lián)用對多糖進行解析。

2.1.1水解法

水解法通過完全水解將多糖鏈分解成單糖，這是分析多糖鏈構(gòu)成成分重要手段。水解法涉及完全酸水解、某些酸水解、乙酰解和甲醇解等。水解后多糖通過中和、過濾可采用氣相色譜、紙層析、薄層層析、高效液相色譜儀[8]和離子色譜法[9]進行分析。

2.1.2高碘酸氧化法

高碘酸可以選取性氧化斷裂糖分子中連二羥基或連三羥基處，生成相應(yīng)多糖醛、甲酸，反映定量進行，每裂開一種C—C鍵消耗一分子高碘酸，通過測定高碘酸消耗量及甲酸釋放量，可以判斷糖苷鍵位置、直鏈多糖聚合度和支鏈多糖分枝數(shù)[10]。

2.1.3Smith降解

Smith降解是將高碘酸氧化產(chǎn)物還原后進行酸水解或某些水解。由于糖殘基之間以不同位置縮合，用高碘酸氧化后則生成不同產(chǎn)物。依照降解產(chǎn)物可以推斷糖苷鍵位置。在降解產(chǎn)物中若有赤蘚糖生成，則提示多糖具備1→4結(jié)合糖苷鍵；若有甘油生成，則提示有1→6、1→2結(jié)合糖苷鍵或有還原末端葡萄糖殘基；若能檢出單糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等,則有1→3糖苷鍵結(jié)合存在[11]。

2.1.4甲基化反映

甲基化反映是用甲基化試劑將各種單糖殘基中游離羥基所有甲基化，進而將甲基化多糖水解后得到化合物，其羥基所在位置即為本來單糖殘基連接位置。甲基化反映核心在于甲基化與否完全，普通采用紅外光譜法檢測3500㎝-1處有無吸取峰,以此來判斷甲基化多糖中與否具有游離羥基(-OH)。甲基化辦法有Purdie法、Hamorth法、Menzies法和Hakomori法等[12]。當(dāng)前使用較多是Ciucanu和Kerek[13]辦法,它是將多糖樣品溶解在DMSO中,加入NaOH粉末和碘甲烷，混合在密封瓶中25℃攪拌6min即可,辦法簡樸,重復(fù)性好。

2.2波譜學(xué)辦法

食（藥）用菌多糖由于構(gòu)造比較復(fù)雜，僅用老式化學(xué)辦法完全解析多糖構(gòu)造是十分困難，必要運用波譜學(xué)知識進行解析。在食（藥）用菌多糖中慣用波譜學(xué)辦法有紫外分光光度計法、紅外光譜法和核磁共振法。

2.2.1紫外分光光度計法

用苯酚硫酸法（490nm）進行多糖含量測定;280nm處有無吸取峰來檢測與否具有蛋白質(zhì)和在260nm處有無吸取峰來判斷與否具有核酸;在620nm處有無吸取峰來判斷有無色素[14];在206nm處有無吸取峰來判斷與否具有多糖[15]。

2.2.2紅外光譜法

紅外光譜分析多糖構(gòu)造，可以鑒定多糖構(gòu)型，如：α構(gòu)型多糖常浮現(xiàn)844±8cm-1峰,而β構(gòu)型多糖浮現(xiàn)891±7cm-1峰。糖鍵上重要取代基特性譜為分子間、內(nèi)氫鍵使糖羥基在3600～3200cm-1處浮現(xiàn)一寬峰，磷酸基在1300～1250cm-1處有P=O伸縮振動峰，磺酸基在1240cm-1處有S=O伸縮振動峰，酯胺在1650、1550cm-1附近浮現(xiàn)振動吸取。吡喃糖苷在1100～1010cm-1處應(yīng)有3個吸取峰，而呋喃糖苷在相應(yīng)區(qū)域只浮現(xiàn)2個峰[16]。

2.2.3核磁共振法

運用核磁共振技術(shù)可以在有或沒有構(gòu)造背景知識狀況下獲得碳水化合物最完全構(gòu)造信息，它突破了用化學(xué)辦法測定多糖構(gòu)造局限性，為復(fù)雜多糖構(gòu)造解析提供了有利工具。通過綜合考慮一維、二維圖譜，互相驗證，得到更為精確多糖構(gòu)造信息。核磁共振波譜多糖構(gòu)造分析辦法簡介如下。

2.2.3.1糖殘基數(shù)擬定

4.3～5.9異頭氫區(qū)域，導(dǎo)致假象。因此對于在1HNMR譜和13CNMR譜中信號峰數(shù)目不同樣時，還要通過1H-1HCOSY譜和1H-13CCOSY譜進行驗證，進而擬定多糖中糖殘基數(shù)[17]。90～112之間。依照浮現(xiàn)信號峰來擬定多糖糖殘基數(shù)。但是在1HNMR譜中，異頭氫區(qū)域信號不一定都是異頭氫信號，例如在O-乙?；〈忌蠚洌m然不是異頭氫，但是其氫化學(xué)位移會由于O-乙?；〈虻蛨鲆苿拥?.3～5.9之間；在13CNMR譜中，異頭碳化學(xué)位移普通在多糖是由單糖以一定連接方式構(gòu)成重復(fù)構(gòu)造單元，由一種或各種單糖構(gòu)成，因此擬定多糖糖殘基數(shù)是很重要。普通來說，糖殘基數(shù)是依照多糖異頭氫和異頭碳來擬定。在1HNMR譜中，異頭氫化學(xué)位移在

2.2.3.2單糖構(gòu)型擬定

82～84之間有信號，也是區(qū)別呋喃糖構(gòu)型和吡喃糖構(gòu)型重要根據(jù)[19]，[20]。吡喃糖構(gòu)型大體又涉及葡萄糖構(gòu)型（葡萄糖和異鼠李糖）、甘露糖構(gòu)型（甘露糖和鼠李糖）和半乳糖構(gòu)型（半乳糖、巖藻糖）。葡萄糖構(gòu)型可以通過J2,3,J3,4,J4,5在8～10Hz之間來判斷[21]，還可以通過H2高場化學(xué)位移特性來判斷?；蛘呤窃赥OCSY譜中，具備一種H1～H6完全自旋系統(tǒng)，也可以視為葡萄糖構(gòu)型[22]。甘露糖構(gòu)型可以通過J1，2(0～2.0Hz)非常小和J4,5(8～10Hz)大偶合常數(shù)來擬定甘露糖構(gòu)型[23]。由于J3,4和J4,5較?。↗3,4和J4,5103～112,并且呋喃糖糖醛糖C4和呋喃糖糖酮糖C5在5.4左右，J1,2不大于2Hz,此是呋喃糖構(gòu)型區(qū)別于吡喃糖構(gòu)型重要特性[18]。在13CNMR譜中，異頭碳化學(xué)位移在構(gòu)成多糖單糖普通可以分為呋喃糖構(gòu)型和吡喃糖構(gòu)型。在1HNMR譜中，呋喃糖構(gòu)型異頭氫化學(xué)位移在<3Hz）,阻礙了從H1→H6有關(guān)傳遞，由此可以推斷半乳糖構(gòu)型存在[24]，同步H4相對于其她單糖殘基而位于低場區(qū)域[26]也可作為判斷半乳糖構(gòu)型根據(jù)。在TOCSY譜中只能推出H1→H4[26]和在NOESY譜中H4與H3和H5有強NOE效應(yīng)也是半乳糖構(gòu)型重要特性[27]。

2.2.3.3單糖組分化學(xué)位移擬定

普通來說，可以通過1HNMR譜、1H-1HCOSY譜和TOCSY（HOHAHA）譜推出單糖上各碳上氫化學(xué)位移，然后依照13CNMR譜和1H-13CCOSY譜（HMQC譜和HSQC譜）推出碳化學(xué)位移。但是對于不同構(gòu)型還略微不同，例如半乳糖構(gòu)型，因J3,4和J4,5較小，阻礙了交叉峰浮現(xiàn)，可以從1H-1HCOSY譜中交叉峰推出H1，H2和H3。由于H3和H4在1H-1HCOSY譜中J3,4較小，因此沒有交叉峰浮現(xiàn)，因而H4可以通過TOCSY（或HOHAHA）譜得出，依照H1有關(guān)交叉峰進行判斷；H5可由NOESY譜得出，由于H3和H4與H5信號有關(guān)。H6可以通過1H-1HCOSY譜和TOCSY（或HOHAHA）譜得出，由于H5和H6在此譜上有交叉峰。H5和H6與H1和H4與否在同一糖環(huán)中，還可以通過HMBC譜，H1和C5有關(guān)、H5和C4有關(guān)、H6和C5有關(guān)來證明H5、H6是同一糖殘基上氫。碳化學(xué)位移可由HMQC譜來推斷，對于未被推出，可用HMQC-TOCSY譜進行輔助，例如：H1與C1、C2、C3和C4有關(guān)，C5與H5、H6a和H6b有關(guān)，還可以通過HMBC譜進行驗證，如：H1與C3、C5，H2與C1，H4與C5和C6有關(guān)等[28，29]。而甘露糖構(gòu)型由于J1,2較小，因此常采用DQF-COSY譜和TOCSY譜結(jié)合來擬定H化學(xué)位移[30]。

2.2.3.4異頭構(gòu)型判斷

4.4～4.8之間，JH1,H2在6～8Hz之間，雙峰[17]。但是甘露糖構(gòu)型不能用此辦法來判斷。由于J1，2非常小，不能用J1,2間偶合常數(shù)來擬定甘露糖α或β構(gòu)型,需通過該單糖殘基上H5[24]和C5[33]化學(xué)位移與已知單糖