高二生物同步講義：基因工程的基本操作程序（教師版）

《第3章基因工程》第2節(jié)基因工程的基本操作程序必會知識考點梳理拓展延伸易錯警示必會知識一目的基因的篩選與獲取1．目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，如與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。2．獲取目的基因的方法(1)從基因文庫中獲取目的基因①基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。②基因文庫的種類：基因組文庫：包含一種生物所有的基因；部分基因文庫：只包含一種生物的一部分基因，如cDNA文庫。cDNA文庫與基因組文庫的區(qū)別文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子(具有啟動作用的DNA片段)無有基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列內(nèi)的非編碼DNA片段)無有基因數(shù)量某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以③從基因文庫中獲取目的基因的方法：用DNA探針從基因文庫中準確提取目的基因。根據(jù)目的基因的核苷酸序列制成一段與之互補的核苷酸短鏈，并用同位素標記，即成為探針?；蛭膸熘凶冃缘腄NA片段，如果有一個DNA片段能和探針片段互補結(jié)合成雜交鏈，這一片段即含有所需的目的基因。(2)利用PCR獲得和擴增目的基因①含義：PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。它是一項根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術(shù)。需要具備的條件有模板、原料、引物、酶、控制溫度等。②原理：利用DNA半保留復制原理，在體外將目的基因的核苷酸序列不斷地加以復制，使其數(shù)量成指數(shù)形式擴增(約為2n，其中為擴增循環(huán)的次數(shù))。③前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。④PCR的反應及其作用條件作用在一定的緩沖液(含Mg2+)中進行提供相對穩(wěn)定的pH環(huán)境；真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活4種脫氧核苷酸作為合成DNA子鏈的原料DNA母鏈作為DNA復制的模板Taq酶(耐高溫)催化合成DNA子鏈引物使Taq酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸溫度控制90℃以上變性：使DNA片段雙鏈解開50℃左右復性：使解開的兩條DNA單鏈分別與相應的引物結(jié)合(退火)72℃左右延伸：Taq酶催化子鏈合成⑤擴增的過程：第一步：將反應體系(包括雙鏈模板、引物、Taq酶、4種脫氧核苷酸以及酶促反應所需的離子等)加熱至90℃以上，使雙鏈DNA兩條鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈，分別作為聚合反應的模板。第二步：將反應體系降溫至50℃左右，使引物分別與模板DNA鏈3'端的相應序列互補配對，這個過程稱為復性。第三步：將反應體系升溫至72℃左右，在Taq酶的催化作用下，將與模板DNA互補的單個核苷酸加到引物所提供的3'—OH上，使DNA鏈延伸，產(chǎn)生一條與模板鏈互補的單鏈DNA。如圖所示：上述三步反應完成后，一個DNA片段就變成了兩個DNA片段，隨著重復次數(shù)的增多，DNA的數(shù)量就以約2n的倍數(shù)增加。PCR的反應過程都是在PCR擴增儀(PCR儀)中完成的。完成后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR產(chǎn)物。必會知識二基因表達載體的構(gòu)建1．基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心。其中心內(nèi)容是使目的基因與運載體結(jié)合，形成重組運載體，最后通過重組運載體將目的基因?qū)胧荏w細胞。2．構(gòu)建基因表達載體的目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。3．基因表達載體的組成及其作用(1)目的基因：外源DNA分子中有遺傳效應的片段。(2)啟動子：位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點，是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達出人類需要的蛋白質(zhì)。(3)終止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是轉(zhuǎn)錄結(jié)束點。(4)標記基因的作用：為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是抗生素抗性基因。3．基因表達載體的構(gòu)建過程(1)用一定的限制酶切割載體，使其出現(xiàn)一個黏性末端(或平末端)的切口。(2)用限制酶切割目的基因，產(chǎn)生與載體一樣的黏性末端(或平末端)。(3)將切下的目的基因片段與載體混合，再加入適量DNA連接酶，使載體與目的基因結(jié)合成重組DNA分子(如圖)。必會知識三將目的基因?qū)胧荏w細胞1．轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實質(zhì)是將目的基因整合到受體細胞的基因組中，可能存在于細胞質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上?；蚬こ讨谐Ｓ玫氖荏w細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞。2．將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法：根據(jù)受體和載體的類型不同，所采用的導入方法也不同，見下表。細胞種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法(CaCl2)受體細胞受精卵或體細胞受精卵常用原核細胞轉(zhuǎn)化過程農(nóng)桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達單子葉植物中常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但是成本較高。操作過程：將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭；然后滴加DNA(含目的基因)至花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→將注射了目的基因的受精卵經(jīng)早期胚胎培養(yǎng)后移入母體子宮或輸卵管→獲得具有新性狀的動物Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞→將重組表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收外源DNA分子必會知識四目的基因的檢測與鑒定1．檢測目的：目的基因?qū)胧荏w細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。2．檢測對象(1)檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因。(2)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA。(3)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。3．檢測方法類型檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子水平檢測目的基因是否插到受體細胞的DNA上從轉(zhuǎn)基因生物中提取DNA，用標記的目的基因作探針，進行DNA分子雜交如果顯示出雜交帶，表明日的基因已插入染色體DNA上目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA從轉(zhuǎn)基因生物中提取mRNA，進行分子雜交(DNA和mRNA之間雜交)如果顯示出雜交帶，表明轉(zhuǎn)錄成功目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應的抗體進行抗原——抗體雜交如有雜交帶出現(xiàn)，表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品個體水平鑒定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性是否相同轉(zhuǎn)基因生物的抗性接種實驗：比較基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性是否賦予了預期抗性或蛋白質(zhì)活性必會知識五DNA片段的擴增及電泳鑒定1．實驗原理(1)DNA片段的擴增①利用PCR可以在體外進行DNA片段的擴增。②PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。③PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。(2)DNA片段的電泳鑒定①DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。②PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。2．材料用具(1)儀器：PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭、電泳裝置(包括電泳儀、電泳槽等)(2)用具：4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。3．方法步驟(1)DNA片段的擴增(2)DNA片段的電泳鑒定必備技能典例精講模型秒殺巧思妙解必備技能一獲取目的基因的方法[例1](2022春·陜西西安·高二?？计谀?下列不屬于獲取目的基因的方法是(

)A．利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 B．從基因組文庫中提取C．從受體細胞中提取 D．利用化學方法人工合成[答案]C．[解析]A、利用mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得目的基因，屬于獲得目的基因的方法之一，A不符合題意；B、獲取目的基因的方法之一是從基因組文庫中獲取，B不符合題意；C、目的基因可以從供體細胞的DNA中直接分離基因，而不是從受體細胞中提取，C符合題意；D、根據(jù)已知氨基酸序列通過化學方法人工合成目的基因是獲取目的基因的方法之一，D不符合題意。故選C。必備技能二PCR技術(shù)的原理、過程及條件[例2](2023·全國·高三專題練習)利用PCR技術(shù)擴增目的基因，其原理與細胞內(nèi)DNA復制類似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列敘述錯誤的是(

)A．用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列B．設(shè)計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對而造成引物自連C．復性溫度過高可能導致PCR反應得不到任何擴增產(chǎn)物D．第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/16[答案]D．[解析]A、用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列，只需要知道一段已知目的基因的核苷酸序列，從而根據(jù)這段序列合成引物，A正確；B、設(shè)計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對而造成引物自連，B正確；C、復性的目的是引物與模板DNA結(jié)合，故復性溫度過高可能導致引物與模板DNA不能結(jié)合，因而使得PCR反應得不到任何擴增產(chǎn)物，C正確；D、DNA復制為半保留復制，DNA復制n次，共形成2n個DNA，其中兩個DNA含有母鏈和子鏈(引物A或引物B)，(2n-2)個DNA都含有子鏈(含有引物A和引物B)，第四輪循環(huán)即DNA復制4次，共形成16個DNA，其中2個DNA含有引物A或引物B，所以第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率為14/16＝7/8，D錯誤。故選D。必備技能三基因表達載體的構(gòu)建[例3](2023·浙江·統(tǒng)考一模)PCR擴增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，下列相關(guān)敘述正確的是(

)A．其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列出現(xiàn)了錯誤B．據(jù)圖甲分析其中翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)陌被嵝蛄信cP可能不同C．運用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ切割啟動子可以識別P基因的序列D．通過PCR技術(shù)一定程度上可以解決融合基因出現(xiàn)排斥的反應[答案]B．[解析]A、結(jié)合圖示可以看出，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后，融合基因連接在啟動子和終止子之間，因而轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，A錯誤；B、結(jié)合圖示可以看出，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但在轉(zhuǎn)錄得到的mRNA序列中，EcoRⅠ識別序列的后兩個堿基與P基因?qū)牡谝粋€堿基構(gòu)成一個密碼子，導致翻譯時核糖體讀取的密碼子順序發(fā)生改變，從而使翻譯出的氨基酸序列改變，B正確；C、啟動子序列中并沒有EcoRⅠ限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，因而無法實現(xiàn)，C錯誤；D、通過PCR技術(shù)擴增出的融合基因中的堿基序列是相同的，因而不能解決融合基因出現(xiàn)的排斥的反應，D錯誤。故選B。必備技能四目的基因?qū)胧荏w細胞的方法[例4](2022秋·江蘇淮安·高三校聯(lián)考期中)在基因工程中，常采用花粉管通道法和土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛毎Ｏ聢D為花粉管通道法的一般原理示意圖。相關(guān)敘述正確的是(

)A．外源DNA進入胚囊最終獲得的種子均含有目的基因B．植物生長各個時期均可通過花粉管通道導入外源DNAC．花粉管通道法最大的優(yōu)點是無需植物組培，技術(shù)簡單D．含外源DNA的種子發(fā)育成植株后均具有相應性狀[答案]C．[解析]A、外源DNA進入胚囊，不一定能整合到染色體上，故最終獲得的種子不一定含有目的基因，A錯誤；B、圖示花粉管通道法應在雌蕊成熟時進行操作，B錯誤；C、花粉管通道法可以直接實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的自然生成，無需經(jīng)過植物組織培養(yǎng)這一過程，C正確；D、含外源DNA的種子發(fā)育成植株不一定均具有相應性狀，還需進行個體生物學水平等的檢測，D錯誤。故選C。必備技能五目的基因的檢測與表達[例5](2022春·陜西渭南·高二統(tǒng)考期末)下列選項中能說明目的基因已成功導入受體細胞中并表達的是(

)A．在棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因B．在大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNAC．在山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列D．在酵母菌細胞中提取到人干擾素[答案]D．[解析]A、在棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因，說明目的基因已經(jīng)導入受體細胞，但不能說明目的基因在受體細胞中表達，A錯誤；B、大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNA，說明目的基因已經(jīng)導入受體細胞且已經(jīng)轉(zhuǎn)錄，但不能說明其經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯表達出蛋白質(zhì)，B錯誤；C、在山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列，說明目的基因已經(jīng)導入受體細胞，但不能說明目的基因在受體細胞中表達，C錯誤；D、基因表達的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白，說明目的基因在受體細胞中表達，D正確。故選D。必備技能六基因工程操作步驟的綜合考查[例6](2022·浙江·模擬預測)如圖是培育抗除草劑玉米的技術(shù)路線圖，含有內(nèi)含子的報告基因只能在真核生物中正確表達，其產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍色。轉(zhuǎn)化過程中愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，會導致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長。下列相關(guān)敘述正確的是(

)A．過程①中除草劑抗性基因插入T－DNA中，導致T－DNA片段失活B．過程②用Ca2＋處理使農(nóng)桿菌細胞壁的通透性改變，成為感受態(tài)細胞C．檢測是否轉(zhuǎn)化成功，過程③應在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)KD．轉(zhuǎn)化過程中未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長是因為基因漂移[答案]C．[解析]A、T－DNA的作用是將目的基因從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物染色體DNA中，因此需要把目的基因插入T－DNA片段中，這樣目的基因才可以轉(zhuǎn)移并整合到植物的染色體DNA中，A錯誤；B、用氯化鈣處理農(nóng)桿菌使其細胞膜通透性改變，成為感受態(tài)細胞，而不是改變農(nóng)桿菌細胞壁的通透性，B錯誤；C、檢測是否轉(zhuǎn)化成功，篩選時在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K，除草劑是用來檢測目的基因是否正確表達，物質(zhì)K是用來檢測有沒有導入真核植物細胞中，C正確；D、基因漂移是目的基因轉(zhuǎn)移到近緣作物中去的現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化過程中愈傷組織表面殘留有農(nóng)桿菌導致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長的現(xiàn)象不屬于基因漂移，D錯誤。故選C。必刷好題基礎(chǔ)演練能力提升巔峰突破1．(2022秋·安徽·高三校聯(lián)考階段練習)體外條件下，DNA復制必須有引物，引物是一小段單鏈DNA或RNA，引物的3?端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵堿基，5?端無嚴格限制，可添加某些序列。下列有關(guān)敘述正確的是(

)A．引物制備的前提是已知目的基因的全部脫氧核苷酸序列B．引物可以作為DNA復制開始時RNA聚合酶的結(jié)合位點C．進行體外DNA復制時，引物設(shè)計要有兩種且不能互補配對D．PCR時，dNTP作為擴增的原料會依次連接到引物的5?端[答案]C．[解析]A、引物制備的前提是已知目的基因兩端的核苷酸序列，A錯誤；B、引物可以作為DNA復制開始時DNA聚合酶的結(jié)合位點，RNA聚合酶的結(jié)合位點位于基因編碼區(qū)上游的啟動子部分，B錯誤；C、進行PCR擴增時引物要與擴增DNA片段兩端互補，有兩種，這兩種引物不能互補避免DNA擴增失敗，C正確；D、PCR時，dNTP作為擴增的原料會依次連接到3'端，5′端可以添加限制酶識別序列，D錯誤。故選C。2．(2022·浙江·統(tǒng)考模擬預測)反向PCR流程如圖所示，該技術(shù)可利用一段已知DNA序列設(shè)計合理的引物，擴增已知序列兩端的未知序列。圖中已知序列一條鏈的堿基排列順序為“5’-AACTATGCGCTCATGA-……-GCAATGCGTAGCCTCT-3'”。下列敘述錯誤的是(

)A．I酶切：用一種限制酶切割DNA，以使兩端未知序列形成相同的黏性末端B．II連接：使用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵C．設(shè)計的兩種引物分別是“5'-AACTATGCGCTCATGA–3’”和“5'-AGAGGCTACGCATTGC-3’”D．對PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。該DNA單鏈序列可能為“5'-AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'”[答案]C．[解析]A、根據(jù)圖示可以看出經(jīng)過I酶切過程后，由于用一種限制酶切割DNA，從而使兩端未知序列形成相同的黏性末端，A正確；B、II過程是將DNA片段連接起來，該過程中使用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，B正確；C、設(shè)計的兩種引物需要與已知序列發(fā)生堿基互補配對，而后向兩側(cè)延伸合成未知序列，因此合成的引物分別是“5'-TCATGAGCGCATAGTT–3’”和“5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3’”，C錯誤；D、對PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列，由于F序列是未知序列，根據(jù)C項中的引物序列做出判斷，該DNA單鏈序列可能為“5'-AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'”，D正確。故選C。3．(2022春·遼寧丹東·高二統(tǒng)考期末)重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，獲得想要的目的基因。某科研團隊運用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因的特定位點引入特定突變，以實現(xiàn)基因的定點突變，原理見圖。下列說法錯誤的是(

)A．過程②需要含Mg2+的緩沖液、DNA模板、引物、四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶等B．若引物1、引物2組成的反應系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應系統(tǒng)中均進行一次DNA分子的復制后，一共會產(chǎn)生2種DNA分子C．經(jīng)過過程④獲得的雜交DNA有2種，其中只有一種可以經(jīng)過過程⑤獲得目的基因D．過程⑤使用耐高溫的DNA聚合酶延伸，不需要引物[答案]B．[解析]A、過程②為PCR反應，需要在一定的添加Mg2+的緩沖液中才能進行，需提供模板DNA、分別與兩條模板鏈結(jié)合的引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶等，A正確；B、兩個反應系統(tǒng)中各自形成兩種DNA分子，但由于引物1和引物4形成兩個與原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA屬于同一種DNA，故總共形成3種DNA分子，B錯誤；C、過程④獲得的雜交DNA有2種，一種3′端為單鏈，一種5′端為單鏈，5′端為單鏈的雜交DNA為所需DNA，C正確；D、過程⑤是延伸過程，該過程使用耐高溫的DNA聚合酶進行催化，不需要引物，D正確。故選B。4．(2022春·河北石家莊·高二統(tǒng)考期末)RT-PCR是將RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的PCR相結(jié)合的技術(shù)，可利用此技術(shù)獲取目的基因，具體過程如圖所示。以下說法錯誤的是(

)A．設(shè)計擴增目的基因的引物時需已知一段目的基因序列B．GC含量高的引物在與模板鏈結(jié)合時，需要更高的溫度C．過程Ⅰ需要加入緩沖液、原料、耐高溫的DNA聚合酶和引物A等D．過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，理論上需要2n-1個引物B[答案]C．[解析]A、引物是一段能與目的基因互補配對的脫氧核苷酸序列，設(shè)計擴增目的基因的引物時需已知一段目的基因序列，A正確；B、若退火溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對，若退火溫度過第引物與模板之間的非特異性堿基配增加，并且G-C之間有三個氫鍵，A-T之間有兩個氫鍵，所以G-C含量越高的引物，退火溫度越高，B正確；C、過程Ⅰ是逆轉(zhuǎn)錄過程，所以需要加入緩沖液、原料、逆轉(zhuǎn)錄酶和引物A等，C錯誤；D、過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，根據(jù)DNA的半保留復制可知理論上需要2n－1個引物B，D正確。故選C。5．(2020秋·天津·高二校聯(lián)考期末)如圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖，以下相關(guān)敘述，正確的是(

)A．用Ti質(zhì)粒作為基因的載體，目的基因的插入位置應該在T-DNA片段內(nèi)，①、②的操作中使用了限制酶和DNA聚合酶B．應用DNA探針技術(shù)，可檢測④細胞中目的基因是否表達C．將重組Ti質(zhì)粒導入土壤農(nóng)桿菌中時，可以用CaCl2處理細菌以增加細胞壁的通透性D．用含有重組Ti質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌去感染正在組織培養(yǎng)中的單子葉植物細胞，再將被感染后的細胞培養(yǎng)成植株，就可能獲得具有抗旱基因的植物[答案]C．[解析]A、農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上。根據(jù)農(nóng)桿菌的這一特點，如果將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以把目的基因整合到植物細胞中染色體的DNA上。①、②的操作中使用了限制酶和DNA連接酶，A錯誤；B、檢測④細胞中目的基因是否表達應使用抗原抗體雜交技術(shù)，B錯誤；C、將重組Ti質(zhì)粒導入土壤農(nóng)桿菌中時，可以用CaCl2處理細菌以增加細胞壁的通透性，使外源DNA容易進入，C正確；D、農(nóng)桿菌易感染雙子葉植物和裸子植物，對單子葉植物沒有感染力，因此用含有重組Ti質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌去感染正在組織培養(yǎng)中的雙子葉植物細胞，再將被感染后的細胞培養(yǎng)成植株，就可能獲得具有抗旱基因的植物，D錯誤。故選C。6．(2022春·山東德州·高二德州市第一中學?？贾軠y)下圖表示運用影印培養(yǎng)法(使在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法)，檢測重組質(zhì)粒是否導入大腸桿菌。下列相關(guān)敘述錯誤的是(

)A．導入大腸桿菌的重組質(zhì)粒中有特殊的標記基因B．影印培養(yǎng)法使用的是固體培養(yǎng)基進行微生物培養(yǎng)C．培養(yǎng)基A和B中的1菌落的類型并不相同D．培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B的化學成分不完全相同[答案]C．[解析]A、運載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因，標記基因可以是抗生素抗性基因或熒光標記基因，以便于重組后進行篩選，A正確；B、為了使菌落的生長位置固定，影印培養(yǎng)法使用的是固體培養(yǎng)基進行微生物培養(yǎng)，B正確；C、培養(yǎng)基A和B中都有1菌落，說明1菌落在兩種培養(yǎng)基里都能存活下來，是相同的菌落，C錯誤；D、培養(yǎng)基A和B的目的是為了篩選出含有目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，兩種培養(yǎng)基的區(qū)別是有各自特殊的篩選物質(zhì)，而培養(yǎng)基的營養(yǎng)、pH等都相同，所以二者的化學成分不完全相同，D正確。故選C。7．(2022秋·黑龍江大慶·高三鐵人中學?？奸_學考試)我國科學家將外源生長激素基因?qū)膈庺~受精卵，培育出轉(zhuǎn)基因鯉魚，與對照組相比，生長速度加快?？茖W家介紹，外源基因?qū)胧荏w細胞后，必須整合到受體細胞的DNA上才能發(fā)揮作用。下列有關(guān)說法錯誤的是(

)A．導入的是DNA分子的一段脫氧核苷酸序列B．將目的基因?qū)雱游锛毎姆椒ㄊ秋@微注射法C．未整合到受體細胞DNA上的生長激素基因也不會被DNA酶水解D．外源基因能整合到其它生物的DNA上是因為它們的結(jié)構(gòu)與組成相類似[答案]C．[解析]A、基因是有遺傳效應的DNA片段，DNA分子是由兩條脫氧核苷酸鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，A正確；B、將目的基因?qū)雱游锛毎鹤畛Ｓ玫姆椒ㄊ秋@微注射技術(shù)，B正確；C、未整合到受體細胞DNA上的生長激素基因，會被DNA酶催化水解，C錯誤；D、外源基因和其它生物的DNA有共同的DNA結(jié)構(gòu)：①DNA分子由兩條反向平行的脫氧核苷酸長鏈盤旋而成。②DNA分子外側(cè)是脫氧核糖和磷酸交替連接而成的基本骨架。③DNA分子兩條鏈的內(nèi)側(cè)的堿基按照堿基互補配對原則配對，并以氫鍵互相連接，D正確。故選C。8．(2022秋·浙江紹興·高三校考階段練習)某轉(zhuǎn)基因植物培育過程如下圖所示。下列敘述錯誤的是(

)A．重組Ti質(zhì)粒的濃度和質(zhì)量會影響其導入農(nóng)桿菌的效率B．與機械法相比，酶解法獲得單細胞的效率更高C．農(nóng)桿菌的濃度和狀態(tài)會影響目的基因?qū)胫参锛毎男蔇．前置篩選和后置篩選所依據(jù)的指標是相同的[答案]D．[解析]A、重組Ti質(zhì)粒的濃度、質(zhì)量和農(nóng)桿菌的濃度都會影響其導入農(nóng)桿菌的效率，A正確；B、與機械法相比，酶解法的優(yōu)點是不會傷害原生質(zhì)體，獲得的原生質(zhì)體數(shù)量多．獲得單細胞的效率更高，B正確；C、農(nóng)桿菌的濃度較高，狀態(tài)好，會提高基因?qū)胫参锛毎男剩珻正確；D、前置篩選是分子水平檢測，以便確定目的基因是否導入受體細胞，后置篩選是看植株是否有相對應的性狀，D錯誤。故選D。9．(2022秋·浙江杭州·高三浙江省杭州第二中學?？茧A段練習)常見的探針有核酸探針和蛋白質(zhì)探針。兩種探針結(jié)構(gòu)和功能均不相同，故而應用在不同的檢測中。而兩種探針的制備過程中所應用的技術(shù)也不相同。請回答下列問題。Ⅰ、蛋白質(zhì)探針的制備。(1)蛋白質(zhì)探針常用_____________技術(shù)來制備。該技術(shù)的基本流程是將_____________注射給實驗動物，獲取的脾細胞與骨髓瘤細胞融合后，用HAT培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)對象。該篩選過程得到的雜交瘤細胞是產(chǎn)生_____________的雜交瘤細胞，接下來要經(jīng)過_____________檢測來獲得產(chǎn)生特定蛋白的雜交瘤細胞。最終將純化得到的特定蛋白結(jié)合上熒光或放射性標記，即為蛋白質(zhì)探針。(2)上述HAT培養(yǎng)基是_____________(填“液體”或“固體”)培養(yǎng)基。融合成雜交瘤細胞后再檢測尋找產(chǎn)生特定目標蛋白的雜交瘤細胞，而不直接在脾細胞中尋找產(chǎn)生特定蛋白的B淋巴細胞的原因是_____________。Ⅱ、不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA(ssDNA)的方法。該方法制備的ssDNA結(jié)合上熒光或放射性標記，即為核酸探針。(3)不對稱PCR中加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物。兩者的比例通常為1:100。PCR反應的最初的若干次循環(huán)中，其擴增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA(dsDNA)，但當限制性引物消耗完后，就會產(chǎn)生大量的ssDNA。據(jù)下圖可知，最后大量獲得的ssDNA是圖中的_____________(填“甲”或“乙”)鏈。(4)若反應最初有a個模板DNA分子，最初的6次循環(huán)擴增產(chǎn)生dsDNA，后10個循環(huán)均只擴增ssDNA，則需要限制性引物_____________個。請繪制這16個循環(huán)中ssDNA的分子數(shù)量隨循環(huán)次數(shù)的變化圖_________。(說明：縱軸的刻度請自行標注。)[答案](1)

單克隆抗體

特定的抗原

抗體

抗體(2)

液體

同一種抗原可能激活多種B細胞，還需經(jīng)過兩次篩選，才能獲得產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞。(3)甲(4)

(27-2)a

前6次，為0，后十次為2n-1個[解析](1)蛋白質(zhì)探針常用單克隆抗體技術(shù)制備；單克隆抗體技術(shù)的流程是將特定的抗原注射給實驗動物，獲取的脾細胞與骨髓瘤細胞融合后，用HAT培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)對象。該篩選過程得到的雜交瘤細胞是產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞；接下來要進行抗體檢測檢測來獲得產(chǎn)生特定蛋白的雜交瘤細胞。最終將純化得到的特定蛋白結(jié)合上熒光或放射性標記，即為蛋白質(zhì)探針。(2)HAT培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基；獲得能分泌所需單克隆抗體的雜交瘤細胞至少需要兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細胞，第二次篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞。在HAT培養(yǎng)基上存活的細胞為雜交瘤細胞，特點是既能迅速大量繁殖，又能產(chǎn)生專一抗體。同一種抗原可能激活多種B細胞，還需經(jīng)過兩次篩選，才能獲得產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞，篩選所依據(jù)的基本原理是抗原與抗體的反應具有特異性。(3)由圖可知非限制性引物與乙鏈配對，最后大量獲得的ssDNA是圖中的甲鏈。(4)假設(shè)反應體系中原來有a個模板DNA，最初6個循環(huán)擴增產(chǎn)生雙鏈DNA，后10個循環(huán)均只擴增一條鏈，若只有一條模板鏈，則6次循環(huán)后，產(chǎn)生DNA數(shù)量為26，每條DNA為兩條鏈，故6次循環(huán)后的數(shù)量為26+1，所用引物需減去模板鏈的數(shù)量，則a個模板DNA擴增個循環(huán)后限制性引物數(shù)量=(27-2)a個。繪制這16個循環(huán)中ssDNA的分子數(shù)量隨循環(huán)次數(shù)的變化圖：前6次，為0，后十次為2n-1個10．(2022春·河北滄州·高二任丘市第一中學?？计谀?人乳鐵蛋白是一種重要的藥用保健蛋白下圖表示利用乳腺生物反應器生產(chǎn)人乳鐵蛋白的部分過程，圖中Tetr表示四環(huán)素抗性基因，Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，五種限制酶的識別序列及切割位點如表所示?；卮鹣铝袉栴}：限制酶BamHⅠBaeⅢBclⅠSau3AⅠNotⅠ識別序列及切割位點(1)一個基因表達載體的組成必須有啟動子、終止子、復制原點、___________、___________等。若選用牛作為轉(zhuǎn)基因動物可將人乳