天津大學(xué)《生物技術(shù)》課件-細(xì)胞工程2

人工條件下，在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。(單克隆抗體、激素、細(xì)胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效應(yīng)細(xì)胞等)有微載體法、微囊法等。微載體是指直徑在50-250μm,能適用于貼壁細(xì)胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。√培養(yǎng)動物細(xì)胞時，先將微載體在血清中浸泡一下(可加快細(xì)胞與微載體的貼附速度),然后將制備好的細(xì)胞懸液和微載體混合孵育一段時間，待細(xì)胞貼附于微載體上后，在轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并借助溫和攪拌系統(tǒng)使細(xì)胞隨載體均勻懸浮于培養(yǎng)液中。這樣細(xì)胞就能夠在微載體表面迅速生√:將貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)融為一體的培養(yǎng)方法，提高了對培養(yǎng)液和培養(yǎng)空間的利用，而且適于各種細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，收獲過程簡單，放大生產(chǎn)容易，因而是一種比較理想的大規(guī)模培養(yǎng)方法。微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，放大容易。細(xì)胞的凍存復(fù)蘇和運輸>動物細(xì)胞在液氮中的保存>動物細(xì)胞的復(fù)蘇：37℃快速融化>動物細(xì)胞的運輸動物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物細(xì)胞培養(yǎng)①動物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多，無細(xì)胞壁，機械強度低，對剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差；④培養(yǎng)過程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在；⑤代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成本高，但附加值也高。動物細(xì)胞融合√細(xì)胞融合的原理與方法細(xì)胞融合的概念細(xì)胞融合(cellfusion):在一定條件下，將不同來源的原生質(zhì)體(除去細(xì)胞壁的細(xì)胞)相融合并使之分化再生，形成新物種或新品種的技術(shù)。細(xì)胞和微生物細(xì)胞需要用酶除去細(xì)胞壁而得原生質(zhì)體后再進行融合。細(xì)胞融合的最初變化是細(xì)胞在促融因子的作用下，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，細(xì)胞之間的質(zhì)膜發(fā)生粘連，細(xì)胞開始融合，然后在培養(yǎng)過程中，進而發(fā)生核融合，通過細(xì)胞融合技術(shù)，可以培育出新物種，打破了傳統(tǒng)的只有同種生物雜交的限制，實現(xiàn)了動物、植物、微生物細(xì)胞之間的雜交，可促進基因重組，對遺傳育種、選育優(yōu)良品系以獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種具有重要實踐意義。一個重要的應(yīng)用：單克隆抗體細(xì)胞融合的原理與方法√細(xì)胞融合包括多個過程，首先兩個親本細(xì)胞并列，細(xì)胞膜相接觸，以后膜組織局部破壞，最終形成包圍融合細(xì)胞的連續(xù)胞膜?！滩煌娜诤戏椒▽?xì)胞膜有不同的作用，但都是在由磷脂雙分子層構(gòu)成√關(guān)鍵是要有脂雙層的接觸，并除去糖蛋白，露出無糖蛋白覆蓋的區(qū)域(形成小孔以交換胞溶膠成分)。喪失感染活性不感染細(xì)胞保留融合活性誘導(dǎo)細(xì)胞融合細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核作為融合劑比病毒更容易制備和控制；促進細(xì)胞融合的能力比較強：PEG與水分子以氫鍵結(jié)合，使自由水消失，導(dǎo)致高度脫水的原生質(zhì)凝集融合；在高頻電場脈沖條件下，細(xì)胞透性增加。21細(xì)胞互相緊密接觸2高壓電脈沖使細(xì)胞膜融合3細(xì)胞質(zhì)也完全融合4細(xì)胞核也發(fā)生了融合34GeoregesKohlerGeoregesKohler1975年英國科學(xué)家將產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞融合，成功建立了單克隆抗體技術(shù)，又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology)。發(fā)揮細(xì)胞免疫的功能；后者具有體液免疫的作用。混合物，它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的。單克隆抗體：由一個克隆的B細(xì)胞產(chǎn)生的完全一樣的抗體。(每個B淋巴細(xì)胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某種抗原決定簇的特異性抗體)難以分離出所需要的特定B細(xì)胞克隆所分泌的抗體，即使將產(chǎn)生不同抗體的B細(xì)胞在體外將其分開，也無法讓其繼續(xù)生長、增殖并分泌抗體從血液中分離單克隆抗體，面臨三個障礙：√不同的抗體結(jié)構(gòu)類似，常規(guī)的分離方法很難區(qū)分√B淋巴細(xì)胞在體外不分裂，無法通過細(xì)胞培養(yǎng)的方式擴增B淋巴細(xì)胞細(xì)胞工程抗體雜交瘤-單克隆抗體技術(shù)核心：用骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology)。單克隆抗體制備過程經(jīng)抗原免疫的BALB/c小鼠的脾臟(6-12周齡)劑量、次數(shù)、間隔、佐劑等視抗原而定；收集時間一般是末次接種后72h處死小鼠，取脾，分離得到B淋巴細(xì)胞◆骨髓瘤細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞癌變形成的，常見的骨髓瘤細(xì)胞包括◆體外可大量增殖，但本身不能產(chǎn)生抗體?！粲霉撬枇黾?xì)胞與經(jīng)特定抗源免疫動物后產(chǎn)生的B淋巴細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力?！粜∈蠊撬枇黾?xì)胞(myelomacell):次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷型(Sp2/0)細(xì)胞融合脾細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞或電擊法√融合比例：骨髓瘤細(xì)胞：脾細(xì)胞=1:5或1:10融合劑：40%PEG(分子量1000-2000)√融合24小時后加HAT培養(yǎng)液；2周后改用HT培養(yǎng)液；2周后；改用一般培養(yǎng)液核苷酸合成途徑 十氨基酸-氨基酸-雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)氨基碟呤⑦☆HAT選擇培養(yǎng)原理HGPRT:次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanth氨基蝶呤是葉酸的類似物，能阻斷從頭合成DNA的正常途徑，因合成應(yīng)急途徑中的酶，它們的作用是將次黃嘌呤和鳥嘌呤轉(zhuǎn)變成次黃嘌呤核苷酸或鳥嘌呤核苷酸以及催化胸腺嘧啶核苷產(chǎn)生脫氧核苷酸，從而融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況：√細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT基因互補而同時獲得HGPRT酶和TK酶的雜種細(xì)胞篩選出來。隨機融合后的細(xì)胞類型淋巴細(xì)胞+骨髓瘤十淋巴細(xì)胞+淋巴細(xì)胞十短期生長骨髓瘤+骨髓瘤不能生長十OO0103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔●稀釋法將效價高的單克隆雜交瘤細(xì)胞篩選出來即小鼠腹腔注射降植丸或液體石蠟，1周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7-10天后出現(xiàn)腹水，無菌采集√用傳統(tǒng)的小鼠和大鼠腹水瘤培養(yǎng)法生產(chǎn)單克隆抗體已不能滿足人類需要。應(yīng)用動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)單克隆√單克隆抗體一經(jīng)問世，就因其具有特異性強和能夠大量生產(chǎn)的特點而顯示巨大的生命力。注射特定的抗原蛋白雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞制備的操作過程骨髓瘤細(xì)胞'單克隆抗體的制備胞表位發(fā)生反應(yīng)，特異性強，純度高，易于實驗標(biāo)準(zhǔn)化和大量制備高度穩(wěn)定性高抗體活性不可知性過于單一性McAb技術(shù)的應(yīng)用◆臨床診斷學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用：各種癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細(xì)菌及血吸蟲等數(shù)百種疾病的診斷生物大分子的分離純化：利用McAb親和層析純化蛋白分子●作為研究工具：作為探針分析和探查抗原結(jié)構(gòu)及分析抗原決定簇分子的功能哺乳動物體細(xì)胞克隆第一只體細(xì)胞克隆羊多莉生物繁殖后代通常是以精、卵細(xì)胞結(jié)合的有性生殖方式進行。通過營養(yǎng)體細(xì)胞繁殖個體的方法稱為無性繁殖?？寺∈侵鸽x體條件下的英國學(xué)者1997年2月27日在世界著名權(quán)威雜志《Nature》宣布的用乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核克隆出一只綿羊“多莉(Dolly)”的消息?！岸嗬颉钡恼Q生，既說明了體細(xì)胞核的遺傳全能性，也翻開了人類以體細(xì)胞核競相克隆哺乳動物的新篇章。此項技術(shù)因而榮登美國《Science》周刊評出的1997年十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)的榜首?？寺《嗬蜓蚴疽鈭D克隆多莉羊示意圖綿羊A取出乳腺細(xì)胞核去核植入綿羊B綿羊B未受精卵融合射體外胚胎發(fā)育綿羊C子宮生產(chǎn)多莉克隆羊多莉的意義與爭議√生產(chǎn)實踐上，遺傳性質(zhì)完全一致的克隆動物能為動物或人生長、發(fā)育、衰老、健康等機