牙膏中金黃色葡萄球菌檢驗方法

附件15牙膏中金黃色葡萄球菌檢驗方法DetectionofStaphylococcusAureusinToothpaste1范圍本規(guī)范規(guī)定了牙膏中金黃金色葡萄球菌的檢驗方法。本規(guī)范適用于牙膏中金黃色葡萄球菌的檢驗。2定義金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽胞，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。3儀器和設(shè)備3.1顯微鏡。3.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。3.3離心機。3.4無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。3.5試管：18mm×150mm。3.6載玻片。3.7酒精燈。3.8三角瓶：250mL。3.9高壓滅菌器。3.10恒溫水浴箱。4培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP液體培養(yǎng)基見總則中3.1。4.2營養(yǎng)肉湯成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g蒸餾水加至1000mL制法：將上述成分加熱溶解，調(diào)pH為7.4，分裝，121℃高壓滅菌15min。4.37.5%氯化鈉肉湯成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉75g蒸餾水加至1000mL制法：將上述成分加熱溶解，調(diào)pH為7.4，分裝，121℃高壓滅菌15min。4.4BairdParker平板成分：胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母浸膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰（LiCl·6H2O）5g瓊脂20g蒸餾水950mLpH7.0±0.2增菌劑的配制：30%卵黃鹽水50mL與除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合，保存于冰箱內(nèi)。制法：將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，冷至25℃±1℃，調(diào)節(jié)pH。分裝每瓶95mL，121℃高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂，冷至50℃，每95mL加入預(yù)熱至50℃左右的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL，搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過48h±2h。4.5血瓊脂平板成分：營養(yǎng)瓊脂100mL脫纖維羊血（或兔血）10mL制法：將營養(yǎng)瓊脂加熱融化，待冷至50℃左右無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成平板，置冰箱內(nèi)備用。4.6甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g0.2%麝香草酚藍溶液12mL蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH為7.4，加入甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中，68.95kPa（115℃10lb）20min滅菌備用。4.7滅菌液體石蠟制法：取液體石蠟50mL，121℃高壓滅菌20min。4.8兔（人）血漿制備取3.8%檸檬酸鈉溶液，121℃高壓滅菌30min，1份加兔（人）全血4份，混勻靜置；2000rpm~3000rpm離心3min~5min。血球下沉，取上面血漿。5操作步驟5.1增菌：取1:10的檢液10mL接種到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h±2h。5.2分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取1~2接種環(huán)，劃線接種到BairdParker平板上，如無此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在BairdParker平板培養(yǎng)基上為圓形，光滑，凸起，濕潤，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。5.3染色鏡檢：挑取血瓊脂平板上分純后的菌落，涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.5mm~1mm。5.4甘露醇發(fā)酵試驗：取血瓊脂平板上分純后的菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入高度為2mm~3mm的滅菌液體石蠟，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。5.5血漿凝固酶試驗：吸取1:4新鮮血漿0.5mL，置于滅菌小試管中，加入待檢菌24h±2h營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物0.5mL，混勻，置36℃±1℃恒溫箱或恒溫水浴中，每半小時觀察一次，6h之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽性。同時將已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物及營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基各0.5mL，分別加入無菌1:4血漿0.5mL，混勻，作為對照。也可使用商品化試劑，按照說明書操作，進行血漿凝固酶試驗。5.6如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)，可從營養(yǎng)瓊脂平