高效液相色譜HPLC簡介

關(guān)于高效液相色譜HPLC簡介HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)—高效液相色譜法是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方法的高效能分離手段:

高性能色譜柱,高精度輸液泵,高靈敏度檢測器…廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域:

醫(yī)藥,環(huán)保,石化,生命科學(xué),食品工業(yè),農(nóng)業(yè)…無論在技術(shù)上,理論上,還是在應(yīng)用上仍處于發(fā)展階段什么是高效液相色譜(HPLC)？第2頁,共57頁，2024年2月25日，星期天液相色譜分析法（一）高效液相色譜分析的流程

1、由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。2、被測物由進(jìn)樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測器，檢測信號由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。3、廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而ＨＰＬＣ改變的是流動相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。（二）高效液相色譜的分離過程

同其他色譜過程一樣，ＨＰＬＣ也是溶質(zhì)在固定相和流動相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。

第3頁,共57頁，2024年2月25日，星期天操作過程圖示

第4頁,共57頁，2024年2月25日，星期天色譜分離的機(jī)理分離是一個(gè)物理的過程。固定相(StationaryPhase)流動相(MobilePhase)樣品(溶解于流動相中的溶質(zhì))第5頁,共57頁，2024年2月25日，星期天HPLC的特點(diǎn)項(xiàng)目高效液相色譜法氣相色譜法進(jìn)樣方式樣品制成溶液樣品需氣化或裂解流動相溶液惰性氣體分離原理吸附、分配、篩析、親和等吸附和分配檢測器UVD、PDAD、RID等TCD、FID、ECD等應(yīng)用范圍低、中、高沸點(diǎn)有機(jī)化合物離子型無機(jī)化合物熱不穩(wěn)定化合物生物活性分子低沸點(diǎn)有機(jī)化合物永久性氣體第6頁,共57頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共57頁，2024年2月25日，星期天

高效液相色譜儀構(gòu)造第8頁,共57頁，2024年2月25日，星期天HPLC的儀器配置及流程第9頁,共57頁，2024年2月25日，星期天檢測器簡介（一）◆

紫外吸收檢測器（UVD）原理：用特定波長的紫外光照射樣品池，通過檢測透光率的變化來測定樣品濃度的檢測器。它具有波長固定，波長可變和光二極管陣列三種類型。特點(diǎn)：選擇性檢測器、對流量和溫度敏感性低、靈敏度較高（10-9g）?！粽酃庵笖?shù)檢測器（RID）原理：監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折射率之差來測量試樣濃度的檢測器。特點(diǎn)：通用性檢測器，溫變化要保持在±0.001℃、靈敏度低（10-6g）。第10頁,共57頁，2024年2月25日，星期天檢測器簡介（二）◆電導(dǎo)檢測器（ECD）原理：監(jiān)測溶液的電導(dǎo)率變化的檢測器。特點(diǎn)：選擇性檢測器、測量時(shí)要求恒溫、對流動相的組成變化有明顯響應(yīng)、靈敏度低（10-3g）。適用于離子型化合物?！魺晒鈾z測器（FLD）原理：某些溶質(zhì)在紫外光激發(fā)后能發(fā)射可見光（熒光）的性質(zhì)檢測。特點(diǎn)：選擇性檢測器、靈敏度高（10-12g）、對流量和溫度敏感性低。第11頁,共57頁，2024年2月25日，星期天檢測器簡介（三）◆蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）原理：通過檢測光散射程度而測定溶質(zhì)濃度的檢測器。色譜柱后流出物在通向檢測器途中，被高速載氣（氮?dú)猓﹪姵伸F狀液滴，再進(jìn)入蒸發(fā)漂移管中，流動相不斷蒸發(fā)，含溶質(zhì)的霧狀液滴形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過檢測器。在檢測器中，光被散射的程度取決于溶質(zhì)顆粒的大小與數(shù)量。特點(diǎn)：消除了溶劑的干擾，不受溫度變化影響，靈敏度高，是通用型檢測器。第12頁,共57頁，2024年2月25日，星期天紫外吸收檢測器有三種類型固定波長紫外吸收檢測器：低壓汞燈提供固定254nm或280nm紫外光?？勺兌嗖ㄩL檢測器：氘燈做光源，光柵分光光二極管陣列檢測器photo－diode－arraydetector（PDAD，PDA,DAD）：鎢燈和氘燈組合光源，進(jìn)入檢測池的不是單色光，而是一段紫外波長上的光。PDA可以輔助定性。第13頁,共57頁，2024年2月25日，星期天液相色譜分析法的特點(diǎn)在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，實(shí)現(xiàn)了分析速度快、分離效率高和操作自動化。兼具分離和分析功能，可以在線檢測。第14頁,共57頁，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法的主要類型及原理1、液-液分配色譜2、液-固吸附色譜3、離子交換色譜4、離子對色譜5、離子色譜6、排阻色譜7、親和色譜(AC)第15頁,共57頁，2024年2月25日，星期天液-液分配色譜

固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。反相鍵合相色譜柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。第16頁,共57頁，2024年2月25日，星期天正相色譜：固定相為極性，流動相為非極性。反相色譜：固定相為非極性，流動相為極性。用的最多，約占60～70％。液相色譜類型第17頁,共57頁，2024年2月25日，星期天色譜柱簡介正相柱------固定相通常為硅膠以及其他具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán)，如（NH2）和氰基團(tuán)（CN）的鍵合相填料。

由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。反相柱------固定相通常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團(tuán)的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。

常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。第18頁,共57頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共57頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共57頁，2024年2月25日，星期天流動相反相色譜最常用的流動相及其沖洗強(qiáng)度

H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃

正相色譜常用的流動相及其沖洗強(qiáng)度的順序正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇第21頁,共57頁，2024年2月25日，星期天液相色譜圖相關(guān)術(shù)語(1)色譜圖相關(guān)術(shù)語:色譜峰(Peak):色譜柱流出組分通過檢測器時(shí)產(chǎn)生的響應(yīng)信號的微分曲線峰底(PeakBase):峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的直線峰高(PeakHeight):峰最大值到峰底的距離峰寬(PeakWidth):在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離半(高)峰寬(PeakWidthatHalfHeight):通過峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線,其與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離第22頁,共57頁，2024年2月25日，星期天HPLC的圖形結(jié)果

--色譜圖(Chromatogram)色譜圖:色譜柱流出物通過檢測器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時(shí)間的曲線圖,其縱坐標(biāo)為信號強(qiáng)度,橫坐標(biāo)為保留時(shí)間.←色譜峰時(shí)間(分)基線↓峰高峰寬響應(yīng)值第23頁,共57頁，2024年2月25日，星期天液相色譜圖相關(guān)術(shù)語(2)色譜圖相關(guān)術(shù)語:峰面積(PeakArea):峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)(StandardError):0.607倍峰高處所對應(yīng)峰寬的一半拖尾峰(TailingPeak):后沿較前沿平緩的不對稱峰前伸峰(LeadingPeak):前沿較后沿平緩的不對稱峰鬼峰(GhostPeak):并非由試樣所產(chǎn)生的峰,亦稱假峰

第24頁,共57頁，2024年2月25日，星期天拖尾

前伸

AB

1/10h

h第25頁,共57頁，2024年2月25日，星期天液相色譜圖相關(guān)術(shù)語(3)色譜圖相關(guān)術(shù)語:基線(Baseline):在正常操作條件下,僅由流動相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號的曲線基線飄移(BaselineDrift):基線隨時(shí)間定向的緩慢變化基線噪聲(N)(BaselineNoise):由各種因素所引起的基線波動保留時(shí)間(tR)(Retentiontime):組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間第26頁,共57頁，2024年2月25日，星期天流動相的選擇原則①樣品易溶，且溶解度盡可能大。②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子。③不妨礙檢測器檢測，紫外波長處無吸收。④粘度低，流動性好。⑤易于從其中回收樣品。⑥無毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高純度，即色譜純。⑧廢液易處理，不污染環(huán)境

第27頁,共57頁，2024年2月25日，星期天提高柱效的方法固定相填料要均一，顆粒細(xì)，裝填均勻流動相粘度低低流速升高柱溫。第28頁,共57頁，2024年2月25日，星期天評價(jià)液相色譜方法的標(biāo)準(zhǔn)第29頁,共57頁，2024年2月25日，星期天α，k'，N∶如何控制分離度?

K′是容量因子，表達(dá)了被分離組分與柱填料的作用強(qiáng)弱。

a

是分離因子，描述兩個(gè)組分分離的好壞程度，是化學(xué)因素。

N是理論塔板數(shù)，描述色譜峰的譜帶展寬程度。第30頁,共57頁，2024年2月25日，星期天改變a的途徑改變固定相改變流動相改變溫度改變樣品的本身性質(zhì)在反相HPLC中溶劑強(qiáng)度會隨著水/有機(jī)流動相中的有機(jī)相增加而增加。第31頁,共57頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共57頁，2024年2月25日，星期天確定最佳的溶劑強(qiáng)度

“試-湊法”，即先用一種可能過強(qiáng)的流動相，在后面的實(shí)驗(yàn)中逐步減小溶劑強(qiáng)度以增加k’，當(dāng)所有譜峰的k’介于1—20時(shí)，其流動相已經(jīng)接近最佳了。采用梯度洗脫的實(shí)驗(yàn)方法，即在20min內(nèi)，高強(qiáng)度的溶劑的比例從5%增加到100%，找出在梯度洗脫期間，流出峰到達(dá)中點(diǎn)的時(shí)間tx(即流出的第一譜峰與最末譜峰之間的中心點(diǎn))，然后用下式計(jì)算合適的流動相離開梯度混合器的時(shí)間tk=tx-2t0-tD.t0為死時(shí)間，tD為溶劑由梯度混合器流出，通過泵和所連管線到達(dá)柱子的時(shí)間最佳溶劑強(qiáng)度時(shí)溶劑濃度%：=初始濃度（%）+tk/20[最終濃度-初始濃度]第33頁,共57頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共57頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共57頁，2024年2月25日，星期天柱類型與溫度選擇性的關(guān)系.柱類型不同，選擇性也不一樣，這與鍵和相有關(guān)。溫度的選擇性，溫度的變化會影響分離度。色譜柱條件流速適中，過高會降低塔板數(shù)。當(dāng)流動相粘度增加時(shí)，塔板數(shù)會降低，對于反相體系，水的粘度較高意味著在高溫時(shí)操作有利于最大限度的增大塔板數(shù)，在50度時(shí)較好。其他因素工作壓力：低于150bar操作時(shí)間：應(yīng)盡可能短峰高：只要檢測靈敏度有限，需要窄而高的峰溶劑應(yīng)用：對日常工作、大量實(shí)驗(yàn)，每次進(jìn)樣少消耗流動相為好第36頁,共57頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共57頁，2024年2月25日，星期天液相色譜貯液器的使用及維護(hù)常用干凈的無水甲醇試劑瓶作貯液器，并要加蓋以防灰塵落入，但瓶蓋與導(dǎo)管之間應(yīng)有縫隙，若過緊會形成真空。貯液并內(nèi)要放置燒結(jié)不銹鋼過濾器，即沉子，孔徑為10μm，其作用是：①防止灰塵進(jìn)入泵缸。②

作為進(jìn)液導(dǎo)管的重物，使導(dǎo)管能沉在并底。

溶劑過濾：常用0.5μm膜過濾。HPLC級溶劑：無微粒，無紫外吸收，已用0.2μm膜過濾。貯液瓶要不定期更換，要有2～3個(gè)備用瓶，定期用酸、水、溶劑清洗。沉子：用三個(gè)月后必須清洗或更換，若未用沉子，則必須用0.5μm膜過濾。

溶劑脫氣脫氣：正相色譜如非水性凝膠色譜的流動相不必脫氣，反相色譜的流動相需要脫氣。He氦氣脫氣：10min可以除去80～90％溶入的氣體，但價(jià)格昂貴真空脫氣：這是最常用的方法，可用真空抽濾流動相的方法代替。超聲脫氣：使用方便，但只能脫氣30％加熱回流：最徹底的脫氣方法，混合流動相不能用第38頁,共57頁，2024年2月25日，星期天流動相不暢的原因

原因管路阻塞長了霉菌管道有大量氣泡造成空化貯液并蓋子太緊

解決方法更換管路用稀硝酸洗去管內(nèi)微生物（洗前必須洗凈醇類）采用色譜的空灌注和濕灌注抬高貯液并或向并內(nèi)加壓去掉沉子

第39頁,共57頁，2024年2月25日，星期天色譜柱使用及維護(hù)（一）在使用前一定要注意看使用說明，了解柱子的使用范圍如pH值等，一般來說，硅膠基質(zhì)：pH2.5～7.0，聚合物填料：pH1～13。極端pH的流動相能溶解硅膠。溫度：高溫下用小顆粒填料柱會引起塌陷，柱效N下降一半：3μm柱，＞40℃；5μm柱，＞70℃。柱的保存：通常灌注純有機(jī)溶劑保存。。定期洗柱：甲醇、乙腈洗掉柱中強(qiáng)保留組分，正向或反向洗，不要流過檢測器，若無效：則換不銹鋼過濾片，并用同種填料加乙醇調(diào)成糊狀，補(bǔ)平柱頭，或挖去2～3mm臟填料，重新填平（填料也可以不同種）。延長柱壽命：修補(bǔ)柱頭；換不銹鋼過濾片；沖洗柱；倒向用（柱效要下降40～60％）。使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度）避免流動相組成及極性的劇烈變化壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號

第40頁,共57頁，2024年2月25日，星期天色譜柱使用及維護(hù)（二）用高質(zhì)量溶劑和水作流動相。流動相脫氣每天結(jié)束時(shí)，先用水洗，再用甲醇洗。若用過緩沖液：必須先水洗30～60min1ml/min），再甲醇洗30min，千萬不可先用甲醇沖洗，否則無機(jī)鹽沉淀堵了管路分析用流動相中若無酸、堿、鹽類物質(zhì)，建議用90％甲醇沖洗30～60min；若分析用流動相中含以上物質(zhì)，要先用10％甲醇（或用與分析用流動相同比例，把含酸、堿、鹽溶液換成水）沖洗1小時(shí)左右，再梯度走到90％甲醇沖洗30～60min（若用多元泵）。有必要時(shí)再循環(huán)幾次，可以適當(dāng)縮短時(shí)間。

若長時(shí)間不用該色譜柱，要沖洗好后，用純甲醇或乙腈封存。及時(shí)換密封圈防止色譜柱堵塞的問題

1：溶劑中的不溶物—應(yīng)使用色譜純?nèi)軇?，膜過濾（孔徑不超過0.45μm）

2：樣品中的不溶物—應(yīng)對樣品進(jìn)行膜過濾（孔徑不超過0.45μm）

3：柱內(nèi)不溶物的形成：由于溶劑的不互溶而產(chǎn)生的沉淀—用能溶解沉淀物的溶劑沖洗色譜柱；在不互溶溶劑中由于進(jìn)樣而產(chǎn)生的沉淀—檢查樣品液和流動相是否互溶；由于溫度的改變或固定相的干涸而產(chǎn)生的沉淀—將色譜柱密封緊，并保持室溫恒定！

。

第41頁,共57頁，2024年2月25日，星期天色譜峰保留時(shí)間問題:保留時(shí)間飄忽不定(各次運(yùn)行之間)系統(tǒng)不穩(wěn)定或未達(dá)化學(xué)平衡泵壓力不穩(wěn)(泵頭里有氣泡)進(jìn)樣體積過大或樣品濃度過大溫度波動流動相混合不均勻色譜柱被污染色譜峰保留時(shí)間問題:保留時(shí)間增加或減少(各次運(yùn)行之間)系統(tǒng)不穩(wěn)定或化學(xué)平衡不足泵流速變化溫度變化色譜柱污染,柱效下降流動相被污染溶劑入口過濾器堵或管路堵塞系統(tǒng)滲漏色譜圖常見問題分析第42頁,共57頁，2024年2月25日，星期天色譜圖常見問題分析色譜峰保留時(shí)間問題:保留時(shí)間改變到一個(gè)新的恒定值流動相不正確或其組成不正確泵流速變化實(shí)際輸液的流速不正確(泵失靈或故障)環(huán)境溫度變化；柱溫不正確色譜柱尺寸或類型不正確色譜柱被污染流動相含有穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑發(fā)生變化輸液系統(tǒng)的梯度滯后體積不正確第43頁,共57頁，2024年2月25日，星期天液相色譜定量分析的基本原理在定性的基礎(chǔ)上定量,需有純物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)物液相色譜定量是相對定量的方法:

即由已知量的純被測物標(biāo)樣推算混合物中被測物的量液相色譜法定量的依據(jù)是:被測組分的量與響應(yīng)值(峰高或峰面積)成正比由已知量的標(biāo)樣可求得定量校正因子定量校正因子:是定量計(jì)算公式中的比例常數(shù),其物理意義是單位響應(yīng)值(峰面積)所代表的被測組分的量測定未知組分的響應(yīng)值,通過定量校正因子即可求得其含量第44頁,共57頁，2024年2月25日，星期天液相色譜定量分析的基本步驟開發(fā)一個(gè)適合定量分析的色譜方法:

確認(rèn)被檢測組分峰,并達(dá)到分離度(R)大于1.5

確定被測組分色譜峰的一致性確定方法的檢測限及定量限;靈敏度及線性范圍用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品建立校正曲線考查定量方法的準(zhǔn)確度及精密度第45頁,共57頁，2024年2月25日，星期天鑒別需定量的色譜峰(定性)定性鑒別每個(gè)要定量的色譜峰通過比較保留值(通常是保留時(shí)間)的方法,找到各色譜峰所對應(yīng)的組份大多數(shù)情況下用與標(biāo)樣比較保留時(shí)間來定性即所謂：保留時(shí)間相同，可能是同樣的組份保留時(shí)間不同，肯定不是同樣的組份進(jìn)一步的確認(rèn)(定性)標(biāo)準(zhǔn)加入同時(shí)用其他方法其他色譜方法（改變機(jī)理，如：用不同的色譜柱）其他檢測器PDA，光譜圖比較、譜庫檢索MS，質(zhì)譜圖解析、譜庫檢索其他儀器方法第46頁,共57頁，2024年2月25日，星期天HPLC定量分析的常用術(shù)語(2)積分(Integrity):由計(jì)算機(jī)對色譜峰進(jìn)行峰面積測量的計(jì)算過程定量限:可以準(zhǔn)確定量的樣品最低量,一般要求色譜峰的S/N＞10:1校正曲線(CalibrationCurve):組分含量對響應(yīng)值的線性曲線,由已知量的標(biāo)準(zhǔn)物建立,用于測定待測物的未知含量常用的定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法,分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法:外標(biāo)法在液相色譜中用得最多內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確，但是麻煩在標(biāo)準(zhǔn)方法中用得最多第47頁,共57頁，2024年2月25日，星期天外標(biāo)法定量（一）配制一系列已知濃度的標(biāo)樣第48頁,共57頁，2024年2月25日，星期天外標(biāo)法定量（二）采集不同濃度標(biāo)樣的色譜圖積分,按外標(biāo)法定量計(jì)算,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線第49頁,