高尚先轉(zhuǎn)化醫(yī)學個體化檢測現(xiàn)狀及展望

關于高尚先轉(zhuǎn)化醫(yī)學個體化檢測現(xiàn)狀及展望轉(zhuǎn)化醫(yī)學（TranslationalMedicine）：1992年，美國《科學》雜志首次提出“從實驗室到病床（BenchtoBedside）”的概念，1996年，在《柳葉刀》雜志上，第一次出現(xiàn)了“轉(zhuǎn)化醫(yī)學”這個名詞，2003年NIH的Zerhouni在Science上發(fā)表文章TheNIHRoadmap后，引起了學界對轉(zhuǎn)化性研究的高度重視。轉(zhuǎn)化醫(yī)學是把醫(yī)學生物學基礎研究成果迅速有效的轉(zhuǎn)化為可在臨床實際應用的理論、技術、方法和藥物的過程。即從實驗室到病床（BenchtoBedside）再從病床到實驗室（BedsidetoBench）的連續(xù)過程，簡稱為“B-to-B或B2B”及從實驗室到公眾健康（BenchtoPublic,B2P）

轉(zhuǎn)化醫(yī)學：基礎研究→臨床應用，“驅(qū)動臨床研究引擎的激發(fā)器”實驗室成果→產(chǎn)業(yè)化

雙向、開放

現(xiàn)代和未來醫(yī)學研究的主要模式

一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學簡介——轉(zhuǎn)化醫(yī)學概念第2頁,共77頁，2024年2月25日，星期天美國轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心：46個，在2012年以前會達到60個以上，NIH投入5億美元/年英國轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究：投入4.5億英鎊，啟動世界上首個轉(zhuǎn)化醫(yī)學合作研究中心歐共體轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究：計劃投入60億歐元三本轉(zhuǎn)化醫(yī)學國際性專業(yè)雜志：ScienceTranslationalMedicine、JournalofTranslationalMedicine和TranslationalResearch一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學簡介——轉(zhuǎn)化醫(yī)學發(fā)展現(xiàn)狀第3頁,共77頁，2024年2月25日，星期天4“4P”醫(yī)學轉(zhuǎn)化醫(yī)學循證醫(yī)學經(jīng)驗醫(yī)學一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學簡介——醫(yī)學模式轉(zhuǎn)變第4頁,共77頁，2024年2月25日，星期天5一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學簡介——“4P醫(yī)學”

Personalized個體化

Predictive

預測Preemptive干預

Participatory參與

新醫(yī)學模式BradleyWG,etal.Radiology.2011Feb;258(2):571-82當代醫(yī)療模式的轉(zhuǎn)換對轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究具有更新、更高的要求：填平基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學之間的鴻溝，讓患者和公眾從醫(yī)學的進步中獲得最大收益，是轉(zhuǎn)化醫(yī)學追求的崇高目標。第5頁,共77頁，2024年2月25日，星期天6一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學簡介——轉(zhuǎn)化醫(yī)學的研究內(nèi)容

轉(zhuǎn)化醫(yī)學是生物醫(yī)學發(fā)展特別是基因組學和蛋白質(zhì)組學以及生物信息學發(fā)展的時代產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化醫(yī)學的中心環(huán)節(jié)是生物標志物的研究。

開發(fā)和利用各種組學方法以及分子生物學數(shù)據(jù)庫，篩選各種生物標志物，用于疾病危險度估計、疾病診斷與分型、治療反應和預后的評估，以及治療方法和新藥物的開發(fā)。

第6頁,共77頁，2024年2月25日，星期天7一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學簡介——三個方面推動“4P”

1.分子標志物的鑒定和應用

基于各種組學方法篩選出早期診斷疾病，預測疾病(個體疾病敏感性預測)，判斷藥物療效和評估患者預后的生物標志物及藥物靶標。

2.基于分子分型的個體化治療

惡性腫瘤和心腦血管病及糖尿病等大多數(shù)慢性病是多病因疾病，其發(fā)病機制復雜、疾病異質(zhì)性很大。因此，對這些疾病不能采用單一方法(如同一藥物、相同的劑量)來進行疾病診治。?；诨颊叩倪z傳、分子生物學特征和疾病基本特征進行分子分型，以此為基礎實施個體化的治療是現(xiàn)代醫(yī)學的目標。分子醫(yī)學(molecularmedicine)和個體化醫(yī)學(personalizedmedicine)都是轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究產(chǎn)生的結(jié)果。

3.疾病治療反應和預后的評估與預測

由于遺傳、營養(yǎng)、免疫等因素的差別，同一種疾病的患者，對同一種治療方法或同一種藥物的效果和預后可表現(xiàn)出較大的差異。在分子生物學研究的基礎上，我們可利用經(jīng)評估有效的生物標志物(如患者的基因分型、生化各種表型指標等)，進行患者藥物敏感性和預后的預測，選擇敏感的藥物和適當?shù)膭┝?，以提高療效和改善預后。通過臨床與實驗室關聯(lián)性研究(clinical—laboratorycorrelativestudies)找出規(guī)律，闡明疾病的發(fā)生發(fā)展機制，以循證醫(yī)學的原則實施醫(yī)療工作。

第7頁,共77頁，2024年2月25日，星期天8一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學簡介——轉(zhuǎn)化醫(yī)學的應用

1.新型的生物標志物在臨床疾病檢測中的應用

2.加快新藥研究的速度第8頁,共77頁，2024年2月25日，星期天9二、個體化醫(yī)學個體化診斷個體化治療在檢測個體基因差別的基礎上，預測疾病的易感性，對疾病進行特異性診斷，評估藥物的反應性，并依此為患病個體制定特異性治療方案，真正做到因人施治。

第9頁,共77頁，2024年2月25日，星期天102.1個體化治療傳統(tǒng)藥物靶向藥物吉非替尼西妥昔單抗基因型基因表型分子水平檢驗臨床因素病理類型患者標本第10頁,共77頁，2024年2月25日，星期天11個體化治療藥物FDA已批準與個體化治療相關藥物113種，預計可開發(fā)的有5000種目前針對個體化檢測靶點已經(jīng)開展的檢測有28個（包括基因多態(tài)性靶點8個）遺傳變異包括基因突變和基因多態(tài)性第11頁,共77頁，2024年2月25日，星期天12EGFR信號通路和惡性腫瘤靶向藥物治療NUCLEUSRafMEKKERKsekMAPKjnk/sapkC-mycC-junPI3KAktintermediatesApoptosisPPRho-BKi-67ExtracellularIntracellularRasYEGFRTKI（吉非替尼，厄洛替尼）mAb(Cetuximab，西妥昔單抗，愛必妥

)凋亡增殖第12頁,共77頁，2024年2月25日，星期天13靶向藥物----個體化治療

一、EGF/EGFR信號轉(zhuǎn)導通路

EGF/EGFR和VEGF/VEGFR通路的靶向治療藥物，是目前應用最為廣泛的。

圖1EGF/EGFR信號轉(zhuǎn)導通路

目前臨床應用較多的針對EGFR和HER2的靶向抑制劑主要有兩類。一類為阻斷胞外受體功能區(qū)的單克隆抗體，如靶向EGFR的愛必妥（Erbitux）和維克替比（Vectibix）及靶向HER2的單克隆抗體trastuzumab（赫賽?。?。這類藥物起作用的指征是對應靶點（EGFR或HER2）表達呈陽性。另外一類靶向藥物為抑制EGFR和HER2胞內(nèi)TK功能區(qū)自磷酸化的小分子藥物。易瑞沙(Iressa)和特羅凱(Tavceva)，通過選擇性抑制酪氨酸激酶活化，從而抑制EGFR激活。這類藥物主要用在結(jié)直腸癌和非小細胞肺癌的治療中。相關診斷試劑

第13頁,共77頁，2024年2月25日，星期天圖2VEGF信號通路

二、VEGF/VEGFR信號通路在大多數(shù)實體腫瘤中可檢測到VEGF的過度表達。根據(jù)干預環(huán)節(jié)的不同，相應的抗血管生成藥分為五類：（1）抑制內(nèi)皮細胞增生或遷移（2）阻止血管細胞外基質(zhì)降解（3）抑制VEGF和(或)VEGFR的產(chǎn)生（4）干擾VEGF和VEGFR的相互作用（5）抑制胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子從而阻斷VEGF/VEGFR信號通路。如VEGF的單抗－貝伐單抗（bevacizumab）、VEGFR1,2,3受體抑制劑－舒尼替尼（sunitinib）和索拉非尼（sorafenib）不但抑制VEGF受體，而且是Raf癌基因通路的抑制劑。FDA批準；結(jié)腸癌癌、非小細胞型肺癌和腎細胞癌的治療。國內(nèi)外尚無相關診斷試劑批準上市相關科研用診斷試劑VEGFRmRNA表達水平第14頁,共77頁，2024年2月25日，星期天152.2個體化診斷NoclincialcancerbiomarkerisabsolutelyspecificIsaacS.ChanandGeoffreyS.Ginsburg.PersonalizedMedicine:ProgressandPromise.Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.2011.12:7.1–7.28第15頁,共77頁，2024年2月25日，星期天16基因型和基因表型檢測第16頁,共77頁，2024年2月25日，星期天17常見個體化藥物靶點及檢測方法第17頁,共77頁，2024年2月25日，星期天18常見個體化藥物靶點及檢測方法第18頁,共77頁，2024年2月25日，星期天19藥物名稱靶標檢測內(nèi)容適用標本化療藥物順鉑/卡鉑ERCC1、GSTmRNA水平手術/穿刺樣本BRCA1mRNA水平/突變手術/穿刺樣本XRCC1基因多態(tài)性血液異環(huán)磷酰胺CYP2CI9*2、CYP2C9*3基因多態(tài)性血液絲裂霉素NQO1*2、NQO1*3基因多態(tài)性血液依托泊苷TOPOⅡa、MDR-1mRNA水平手術/穿刺樣本CYP3A4*4、UGT1A1基因多態(tài)性血液長春瑞濱TUBB3、STMN1mRNA水平手術/穿刺樣本紫杉醇/多西紫杉醇TUBB3、STMN1、mRNA水平手術/穿刺樣本CYP2C8*3基因多態(tài)性血液伊立替康UGT1A1*28、UGT1A1*6基因多態(tài)性血液吉西他濱RRM1mRNA水平手術/穿刺樣本培美曲賽TSmRNA水平手術/穿刺樣本常見化療藥物與檢測靶點第19頁,共77頁，2024年2月25日，星期天20臨床研究已證實ERCC1參與鉑類耐藥發(fā)生，其表達水平與多種癌癥鉑類化療療效和生存期呈負相關，即表達水平低的患者對鉑類藥物敏感，反之表達水平高的患者表現(xiàn)耐藥。美國國家癌癥綜合治療聯(lián)盟（NCCN）2009年版臨床治療指南中明確指出：接收鉑類化療前進行ERCC1mRNA檢測可提高治療有效率和患者生存率。ERCC1（ExcisionRepairCrossComplementGroup1，核苷酸切除修復交叉互補基因1）化療藥物和成熟位點：鉑類藥物與基因-ERCC1第20頁,共77頁，2024年2月25日，星期天21核糖核苷酸還原酶M1

（RRM1）腫瘤組織中基因表達水平低的患者，對吉西他濱藥物敏感，高表達患者表現(xiàn)耐藥。吉西他濱檢測基因-RRM1腫瘤組織中基因表達水平高的患者，生存效果更佳。第21頁,共77頁，2024年2月25日，星期天22伊立替康（轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌）代謝伊立替康(前藥-無活性)酯酶SN-38(活性)UGT1A1(肝臟內(nèi))SN-38G膽汁(TA)6TAA(TA)7TAAUGT1A1活性SN-38濃度6/6野生型7/7突變型第22頁,共77頁，2024年2月25日，星期天結(jié)腸癌患者，考慮使用伊立替康時進行UGT1A1基因型檢測第23頁,共77頁，2024年2月25日，星期天24UGT1A1TA重復序列與伊立替康35.716.38.6051015202530354045506/66/77/7P=0.007UGT1A1genotype%grade4/5neutropeniaN=52441.933.814.30510152025303540456/66/77/7UGT1A1genotypeObjectiveresponse(%)P=0.045FromMcLeodetal,2004第24頁,共77頁，2024年2月25日，星期天25肺癌個體化檢測不清楚不清楚1987年KRAS突變2004年EGFR突變KRASKRAS

EGFR2009年肺腺癌分子分型KRASHER2BRAFALKfusionPIK3CAMEK1ROSfusionPDGFRamp不清楚突變預測EGFRexon19del/L858RSenstoEGFRTKIsKRASRestoEGFRTKIsEGFRT790M/D761Y/T854ARestoEGFRTKIs;senstonewTKIs?METamplificationSenstoMETTKIsMEK1SenstoMEKinhibitorsHER2SenstoHER2TKIsBRAFSenstoBRAFinhibitorsALKfusionsSenstoALKinhibitorsPDGFRa

amplificationSenstoPDGFRinhibitorsPIK3CAPIK3CAinhibitors?ROSfusionSenstoROSinhibitors?肺腺癌的個體化分子靶向治療第25頁,共77頁，2024年2月25日，星期天26非小細胞肺癌（NSCLC）與EGFR基因突變ModernPathology(2012)25,347–369第26頁,共77頁，2024年2月25日，星期天27EML4-ALK融合基因檢測EML4-ALK融合基因約占NSCLC的4%（0.4-11.6%）第27頁,共77頁，2024年2月25日，星期天28個體化檢測PCR技術基因芯片技術蛋白質(zhì)組學技術SNP技術質(zhì)譜色譜技術臨床樣本檢驗醫(yī)學Allpatientswithsamediagnosis12Respondersandpatients

notpredisposedtotoxicityNon-respondersandtoxicrespondersTreatwithalternativedrugordoseTreatwith

conventionaldrugordose"Here'smysequence..."臨床患者個體化治療臨床醫(yī)學2.3檢驗醫(yī)學——推動臨床醫(yī)學走向個體化醫(yī)學第28頁,共77頁，2024年2月25日，星期天29國內(nèi)外個體化檢測試劑現(xiàn)狀預測性

例唐氏綜合癥篩查試劑盒,FDA批準的蛋白HE4和CA125檢測聯(lián)合卵巢惡性腫瘤風險計算法（ROMA），在測定絕經(jīng)前后女性卵巢癌風險性上具有很高的準確性。診斷性例常見腫瘤標志物CEA、AFP、CA系列等診斷試劑，胃癌標志物Hab18G/CD147等藥物療效例白血病融合基因、拉米夫定耐藥突變、利福平耐藥突變,華法林藥物敏感等檢測試劑盒第29頁,共77頁，2024年2月25日，星期天藥物靶點例EGFR、K-ras、Braf突變檢測試劑盒等，尚有10余種處于注冊批準階段,如ERCCI、BRCA等轉(zhuǎn)移性例循環(huán)腫瘤細胞、CK-19、CK-18等檢測試劑盒;易感性尚無診斷試劑盒獲批按照診斷試劑注冊管理辦法該類診斷試劑基本上都屬于三類，且種類繁多第30頁,共77頁，2024年2月25日，星期天31三、個體化檢測技術形態(tài)學

免疫分型

免疫球蛋白電泳免疫組化

基因定性、定量基因突變檢測

MSI（微衛(wèi)星不穩(wěn)定性）

WHO規(guī)范化腫瘤綜合檢測，應用MICM分類標準，結(jié)合了形態(tài)學(M)免疫學(I)細胞遺傳學(C)，分子生物學（M），使分型更加準確免疫學細胞遺傳學分子生物學

常規(guī)病理

血細胞涂片

核型分析

熒光原位雜交MICM未來-預測性檢測多方法平臺/多因素檢測/多基因信號/多樣本類型–尿樣、唾液、呼吸、其他/增加診斷性影像檢查的應用第31頁,共77頁，2024年2月25日，星期天32PCR-Sequencing

(20%)PCRpurificationSequencingreactionpurificationsequencingdataanalysisEGFR19DelsEGFR21L858R第32頁,共77頁，2024年2月25日，星期天33PCR-MASSSensitivity(5％）PCR

extentionMASS第33頁,共77頁，2024年2月25日，星期天34ARMSPCR(1%)Specific

for

mutation第34頁,共77頁，2024年2月25日，星期天35real-timeScorpionsARMSPCR第35頁,共77頁，2024年2月25日，星期天363.2國內(nèi)現(xiàn)有EGFR基因突變檢測方法2012衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評臨床實驗室使用技術方法回報第36頁,共77頁，2024年2月25日，星期天37EGFR基因突變檢測使用儀器實時熒光PCR儀測序儀焦磷酸測序儀其它AgilentMx3000PABI3730/ABI3730xlQIAGENPyroMarkQ24Luminex?200TMBIO-RADCFX-96beckmancoulterCEQ8800遺傳定量分析系統(tǒng)PyroMarkQ96ID變性高效液相色譜儀WAVE4500ABIStepOnePlusABI3100-AvantABI7300BECKMANCEQ8000ABI7500AB3500/ABI3500XLABI7500FASTBio-RadMINI-OPCTIONIIQIAGENRotor-Gene?QLightCycle4802012衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評臨床實驗室使用儀器回報第37頁,共77頁，2024年2月25日，星期天38個體化檢測技術方法多樣化，多種方法并存，包括：ARMS、流式熒光雜交法、PCR-直接測序、PCR-焦磷酸測序法、實時熒光PCR法、HRM、DHPLC等。但是很多實驗室使用自制的試劑，實驗流程也缺乏一定的規(guī)范和標準，必須避免個體化用藥形成一種沒有規(guī)范管理下的混亂狀態(tài)，實現(xiàn)整個行業(yè)的規(guī)范化和標準化勢在必行。第38頁,共77頁，2024年2月25日，星期天393.3新方法研究一步法酶切富集突變體ARMSreal-timePCR

人為引入酶切位點實時內(nèi)切酶酶切富集突變體ARMSreal-timePCR阻斷劑富集突變體ARMSreal-timePCR

第39頁,共77頁，2024年2月25日，星期天40一步法酶切富集突變體ARMSreal-timePCR酶切：37℃溫育30min；Nest-PCR富集：95℃15sec，65℃20sec，72℃60sec，5-10Cycles；ARMS引物檢測突變位點：95℃15sec，60℃30sec，40Cycles；Nest-FNest-R400-500bpARMSPrimer-R優(yōu)點：酶切、富集、熒光定量PCR在同一反應體系中，一步法完成檢測。提高了特異性和選擇性。第40頁,共77頁，2024年2月25日，星期天41一步法酶切富集ARMS-Taqman方法的建立L858R檢測曲線在5000Copies的L858R野生型質(zhì)粒背景下，依次存在10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%突變率，可檢出0.1%突變率Theagreementsofbothtestswere96.7%and93.5%withaKappavalueof0.889and0.716forL858RandE746A750del,LungCancer2011(74):226-232第41頁,共77頁，2024年2月25日，星期天42人為引入酶切位點實時內(nèi)切酶酶切富集突變體ARMSreal-timePCRMismatchprimerPCRWildtypedigestionWildMutationaddaenzymesiteNoenzymesiteDigestionandPCRwereperformedinarunInterJournalofCancer2012NoCycleNestCycle第42頁,共77頁，2024年2月25日，星期天43在106Copies/

l的野生型質(zhì)粒背景下，依次存在1%、1‰、0.1‰、0.01‰、0%突變率，可檢出0.01‰突變率——T790M(EuropeanJournalofCancer2012submitteddata)NoBlockerBlocker阻斷劑富集突變體ARMSreal-timePCR第43頁,共77頁，2024年2月25日，星期天443.4個體化檢測技術發(fā)展趨勢——測序技術第一代測序儀僅僅是提供一個電泳和電泳后分析的平臺第二代測序儀則利用微加工處理和光電子成像技術實現(xiàn)邊反應邊測序第三代測序儀則將反應體系進一步縮小到了微納米量級的尺度，同時利用物理原理實現(xiàn)了單分子識別未來的第四代測序技術幾乎完全拋棄了生化反應，通過力學、電學等對DNA分子中的堿基直接判讀第44頁,共77頁，2024年2月25日，星期天45個體化檢測技術發(fā)展趨勢——蛋白質(zhì)組學腫瘤患者和正常人差異蛋白：診斷腫瘤原位與轉(zhuǎn)移比較：腫瘤轉(zhuǎn)移相關蛋白……

主要技術應用第45頁,共77頁，2024年2月25日，星期天46個體化檢測技術發(fā)展趨勢——外周血檢測替代檢測方案：手術后、不愿穿刺患者、對獲得性耐藥進行檢測研究結(jié)果血漿和組織切片檢測陽性突變率不一致，突變一致性為30%,檢測出不同突變類型不建議作為常規(guī)檢測樣本類型,在無法獲得腫瘤組織樣本的情況下的參考血漿/血清游離DNA一些腫瘤患者血漿中有足夠的游離DNA(是正常人的10倍)。血漿中的游離DNA主要由凋亡和壞死的腫瘤細胞產(chǎn)生，其遺傳學特性與腫瘤基因組DNA相似。組

織合計突變無突變血液突變909無突變207191合計2971100(unpublisheddata)第46頁,共77頁，2024年2月25日，星期天47乳腺癌個體化檢測個體化檢測試劑發(fā)展趨勢—新型標記物不斷涌現(xiàn)MitchDowsett,etal.Emergingbiomarkersandnewunderstandingoftraditionalmarkersinpersonalizedtherapyinbreastcancer.ClinCancerRes.2008,14(24).傳統(tǒng)的標志物生物標志物臨床意義雌激素受體激素治療預測因子孕激素受體ER+腫瘤預后

新發(fā)現(xiàn)標志物HER2赫賽汀治療預測因子雌激素受體陽性患者的“21基因檢測”（OncotypeDx）淋巴結(jié)陰性、ER+腫瘤化療效果預測淋巴結(jié)陰性、ER+腫瘤復發(fā)、預后高通量基因檢測系統(tǒng)MammaPrint淋巴結(jié)陰性腫瘤復發(fā)風險預后尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)過表達表示淋巴結(jié)節(jié)陰性腫瘤遠端轉(zhuǎn)移風險高基因組學等級指數(shù)隨時間遠端轉(zhuǎn)移風險估計第47頁,共77頁，2024年2月25日，星期天483.5檢測試劑盒主要技術指標核酸擴增檢測用試劑（盒）行業(yè)標準基因突變檢測試劑盒主要技術指標第48頁,共77頁，2024年2月25日，星期天核酸擴增檢測用試劑（盒）行業(yè)標準不適用于基因分型、基因芯片和病毒基因分型/突變檢測用試劑（盒）及血源篩查的試劑（盒）技術要求要點外觀溯源性（不適用）測量系統(tǒng)的線性（不適用）準確度分析特異性亞型檢測能力（不適用）精密度檢測限/定量限（針對定量試劑）（正式名稱均不稱靈敏度）干擾物質(zhì)穩(wěn)定性第49頁,共77頁，2024年2月25日，星期天50基因突變檢測試劑盒主要技術指標外觀和裝量重復性/精密度準確度（突變型的檢測能力）分析特異性（如正常野生型基因組、突變型之間）檢測限（針對定性試劑，檢出突變型的copies/test）選擇性（針對突變型和野生型不同比例設定的技術要求如5%）檢測限和選擇性可放在一起進行檢測第50頁,共77頁，2024年2月25日，星期天51目前體細胞突變檢測遇到的問題分析特異性：不同的突變型之間，部分試劑盒存在交叉反應野生型基因組背景正常提取濃度的野生型基因組部分試劑盒有明顯的非特異反應選擇性：病理組織中突變體的分布不均一，影響選擇性突變比例對藥物應用指征關系不明確外周血檢測突變的可行性第51頁,共77頁，2024年2月25日，星期天523.6個體化檢測試劑質(zhì)量保證:樣本標本

組織：腫瘤細胞的比例(70%以上)1）新鮮2）石蠟：良好的內(nèi)控

細胞

外周血第52頁,共77頁，2024年2月25日，星期天個體化檢測試劑質(zhì)量保證:重復性影響因素樣本的異質(zhì)性及代表性標本的穩(wěn)定性（新鮮樣本的保質(zhì)如運輸、存儲等）操作規(guī)范化試劑盒各組分的穩(wěn)定性

第53頁,共77頁，2024年2月25日，星期天個體化檢測試劑質(zhì)量保證——特異性、選擇性

分析特異性避免突變型之間的交叉反應；減少野生型基因組背景的非特異反應檢測限與分析特異性通常檢測限與分析特異性是一對矛盾檢測限：突變型的copies

臨床樣本檢測限/選擇性：測序20%<20%,對比試劑或臨床療效驗證

實驗室檢測限突變型質(zhì)粒copies/test實驗室檢測限/選擇性：質(zhì)粒1%-0.1%

背景:10ng

5%、1%100ng-500ng提高特異性

選擇性不降或提高0.1%?高特異性高選擇性可能用于外周血檢測第54頁,共77頁，2024年2月25日，星期天553.7個體化檢測試劑臨床應用:EGFR突變豐度/選擇性探討基因突變豐度與臨床應用的指導意義WuYilongetalJOURNALOFCLINICALONCOLOGYVOLUME29NUMBER24AUGUST202011第55頁,共77頁，2024年2月25日，星期天體細胞突變不同檢測方法比較

檢測限/選擇性：針對組織標本是否越高越好？

第56頁,共77頁，2024年2月25日，星期天細胞周期的劃分：G1期→S期→G2期→M期，以及G0期。

G1期:進行細胞生長及準備染色體復制，S期:進行染色體復制,使DNA成為相同的兩份，G2期:制造蛋白質(zhì),準備細胞分裂的所需物質(zhì)，M期：有絲分裂；為進行核裂(染色體分離)和質(zhì)裂(細胞質(zhì)分裂)的階段。

當細胞處于G0期時就會停止細胞一切的復制分裂過程化療藥只對處于增殖期的腫瘤細胞起作用，而對休眠期的腫瘤細胞是不起作用的厄洛替尼（TKI，針對NSCLC）誘導細胞停滯在G1期，而許多化療藥物作用在其他細胞周期，如多西他賽誘導細胞停滯在M期并凋亡，因此當這兩類藥物被聯(lián)合使用時可能存在拮抗作用：厄洛替尼引起的G1期停滯，使較少細胞能夠進入其他細胞周期時相，從而阻斷多西他賽對M期細胞的活性。這可能解釋為什么這兩類藥物聯(lián)合應用但沒有產(chǎn)生協(xié)同作用?；熕幒蚑KI不能聯(lián)合應用第57頁,共77頁，2024年2月25日，星期天58EGFR基因突變比例研究技術手段：ARMSrealtimePCR體系SequenomMassARRAY體系ARMS體系擴增曲線：從左到右依次為100%、80%、40%、20%、10%、5%、0%的L858R突變質(zhì)譜對模擬樣本分析峰圖：從左到右依次為100%、80%、40%、20%、10%、5%、0%、陰性對照(unpublisheddata)第58頁,共77頁，2024年2月25日，星期天59EGFR基因L858R突變比例檢測結(jié)果(unpublisheddata)L858RmutationNumberPercent（%）＞20%1571.410-20%314.3＜10%314.3Total21100L858Rmutation（21/151）、19DELmutation（35/151）第59頁,共77頁，2024年2月25日，星期天60EGFR基因T790M耐藥突變比例檢測結(jié)果(unpublisheddata)第60頁,共77頁，2024年2月25日，星期天613.8基因突變類標準物質(zhì)室間質(zhì)量評價質(zhì)控品包含常見突變滿足大多數(shù)檢測方法要求盡可能模擬全部檢測過程可以使用突變細胞系、組織切片等國家基因突變類標準物質(zhì)盡可能覆蓋大多數(shù)突變滿足絕大多數(shù)檢測方法要求盡可能考核試劑盒的全部性能指標，包含準確性、分析特異性、檢測限/選擇性等可以使用重組質(zhì)粒、突變細胞系，如組織切片具有可行性是最好選擇第61頁,共77頁，2024年2月25日，星期天62EGFR基因突變候選國家參考品突變細胞株：如EGFR突變細胞系SW48、H1975、H1650包含的突變位點有19號外顯子缺失、18外顯子G719S和20外顯子T790M、21外顯子L858R四個突變位點質(zhì)粒：各種突變型和野生型質(zhì)粒，如EGFR突變國家參考品組成：29種EGFR突變體參考品、5份野生型參考品、1份重復性EGFR突變體參考品。人類基因組背景：不同濃度野生型背景對檢測結(jié)果影響明顯

第62頁,共77頁，2024年2月25日，星期天63EGFR基因突變候選國家參考品的應用10ng野生型基因組背景的29種突變體參考品檢測結(jié)果準確；在高濃度野生型基因組（300ng）背景下，出現(xiàn)假陽性第63頁,共77頁，2024年2月25日，星期天64四、個體化檢測試劑管理和審批管理辦法技術指導原則質(zhì)量評價第64頁,共77頁，2024年2月25日，星期天654.1個體化檢測相關體外診斷試劑注冊審批管理涉及個體化檢測體外診斷試劑的注冊審批按照《體外診斷試劑注冊管理辦法》（試行）進行管理美國體外診斷產(chǎn)品（含體外診斷試劑）按醫(yī)療器械管理。

分為I類、Ⅱ類、Ⅲ類。I類、Ⅱ類、Ⅲ類產(chǎn)品的生產(chǎn)均應符合GMP規(guī)范（除豁免GMP的I類產(chǎn)品外）。上市前的監(jiān)管還包括要求進行符合要求的臨床研究。歐盟歐盟根據(jù)體外診斷產(chǎn)品危險性不同，將其分為A類、B類和不需經(jīng)審評委員會審評的產(chǎn)品三類，實行分類管理。歐盟對體外診斷產(chǎn)品的生產(chǎn)過程按ISO9001和EN46001的要求進行管理。中國

《體外診斷試劑注冊管理辦法》（試行），分為I類、Ⅱ類、Ⅲ類，Ⅱ類、Ⅲ類按要求進行臨床試驗。第65頁,共77頁，2024年2月25日，星期天個體化檢測方法的建立、確證和臨床應用篩選靶標建立檢測方法確證候選生物靶標發(fā)現(xiàn)臨床試驗注冊檢測方法獲得批準取證確證向?qū)嶒炇彝茝V市場臨床/實驗室培訓第66頁,共77頁，2024年2月25日，星期天67在臨床試驗法規(guī)方面，由于新技術、新產(chǎn)品的不斷出現(xiàn)，在臨床設計方面有著其特殊性，現(xiàn)有的《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》法規(guī)對臨床例數(shù)的規(guī)定與產(chǎn)品臨床試驗方案設計的科學性有時存在很大的矛盾，如檢測的不同樣本類型、陽性率低的罕見分型等的納入例數(shù)要求并不明確，這些問題都是有待新法規(guī)或藥監(jiān)部門的技術指導原則出臺來解決。由于個體化醫(yī)學檢測項目涉及范圍較廣、發(fā)展較快，絕大部分的相關檢測還沒有經(jīng)過國家藥監(jiān)部門批準的商品試劑盒，可考慮借鑒發(fā)達國家在這方面的經(jīng)驗，建立類似美國實驗室認證的監(jiān)管機制。即實驗室自主研發(fā)的檢測符合特定實驗室質(zhì)量管理體系要求即可作為該項技術進入臨床應用的許可，但不允許外售給其他實驗室或醫(yī)療機構(gòu)并在有同類項目獲得批準后即撤銷該項目在實驗室的應用認證。從而滿足臨床需求，促進我國個體化診斷和治療科學高效產(chǎn)業(yè)化。同時完善監(jiān)管技術，加強標準物質(zhì)和標準研究，更好的為產(chǎn)業(yè)和臨床服務。第67頁,共77頁，2024年2月25日，星期天臨床試驗1000例陽性大于300例罕見型具有統(tǒng)計學意義對照試劑金標準測序20%；<20%,對照試劑或臨床療效驗證

第68頁,共77頁，2024年2月25日，星期天694.2技術指導原則FDA發(fā)布的與生物標志物診斷試劑相關的指導原則：心臟移植基因表達分析測試系統(tǒng)GuidanceforIndustryandFDAStaff-ClassIISpecialControlsGuidanceDocument:CardiacAllograftGeneExpressionProfilingTestSystems2009藥理學試驗及遺傳標記的基因測試指南GuidanceonPharmacogeneticTestsandGeneticTestsforHeritableMarkers2007乳腺癌預后的基因表達分析GuidanceforIndustryandFDAStaff-ClassIISpecialControlsGuidanceDocument:GeneExpressionProfilingTestSystemforBreastCancerPrognosis；2007CFTR基因突變檢測系統(tǒng)ClassIISpecialControlsGuidanceDocument:CFTRGeneMutationDetectionSystems2005與宮頸癌關聯(lián)的HPV檢測相關Gui