T-CPMA 032-2023 病原微生物菌（毒）種分離和鑒定方法 施萬菌

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11.020學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載CCS

C

04 T/CPMA

032—2023病原微生物菌（毒）種分離和鑒定方法施萬菌

—Shewanella

spp.2023

-

10

–

發(fā)

布兔兔ｗ學(xué)ｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

032—2023兔兔ｗ學(xué)ｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載 前 言

...........................................................................

II1

范圍

................................................................................

12

規(guī)范性引用文件

......................................................................

13

術(shù)語和定義

..........................................................................

14

縮略語

..............................................................................

15

設(shè)備和材料

..........................................................................

16

培養(yǎng)基和試劑

........................................................................

17

分離和鑒定程序

......................................................................

28

操作步驟

............................................................................

3樣品類型和處理

..................................................................

3

............................................................................

3分離培養(yǎng)

........................................................................

3初步鑒定

........................................................................

3微生物自動鑒定系統(tǒng)實驗

..........................................................

4

確證實驗.....................................................................

4附 錄 A （資料性）

施萬菌病原學(xué)....................................................

7附 錄 B （規(guī)范性）

設(shè)備和材料......................................................

8附 錄 C （規(guī)范性）

培養(yǎng)基和試劑....................................................

9C.1

施萬菌增菌液.....................................................................

9C.2

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）瓊脂...........................................

9C.3

營養(yǎng)瓊脂.........................................................................

9C.4

三糖鐵瓊脂（）................................................................

9C.5

氧化酶試劑......................................................................

10C.6

5×

電泳緩沖液................................................................

10附 錄 D （規(guī)范性）

施萬菌種水平的鑒定（

法）

..................................

11D.1

核酸模板制備....................................................................

11D.2

反應(yīng)體系

...................................................................

11D.3

擴增條件....................................................................

11D.4

擴增產(chǎn)物分析

...................................................................

11D.5

MLSA

進化樹

................................................................

11D.6

結(jié)果判定

.......................................................................

12參 考 文 獻

.......................................................................

13學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

032—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載 本文件按照GB/T

1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則

第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提出。本文件由中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會歸口。病預(yù)防控制中心、中日友好醫(yī)院、北京市順義區(qū)疾病預(yù)防控制中心。蔡紅艷、肖悅、高鶴、白雪梅。II學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

032—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載1 范圍本文件規(guī)定了施萬菌的分離和鑒定方法。本文件適用于全國各級病原微生物菌（毒）種保藏機構(gòu)，以及涉及人間傳染的施萬菌研究、教學(xué)、檢測、診斷等相關(guān)活動的機構(gòu)。2 規(guī)范性引用文件文件。T/CPMA

011

病原微生物菌（毒）種保藏數(shù)據(jù)描述通則3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。施萬菌屬 Shewanella

HS，在人體可導(dǎo)致皮膚和軟組織感染、菌血癥、肝膽疾病、中耳炎和其他感染。

4 縮略語下列縮略語適用于本文件。bp：堿基對（Base

pair）：多位點序列分析（Multilocus

Sequence

）PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)

（

Chain

Reaction）5 設(shè)備和材料見附錄B。6 培養(yǎng)基和試劑ｗｗ．ｂｚｆｘｗ兔ｗ兔學(xué)．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

032—2023ｗｗ．ｂｚｆｘｗ兔ｗ兔學(xué)．ｃｏｍ標準下載見附錄

C。7 分離和鑒定程序分離和鑒定流程見圖

1。樣品（臨床、食品、環(huán)境）樣品處理增菌：施萬菌增菌液36

℃±1

℃，

h～

h分離培養(yǎng)：

36

℃±1

℃，

h～

h直徑

1-3mm、圓形、光滑凸起、綠色不透明，帶或不帶黑色中心36

℃±1

℃，

h～

h營養(yǎng)瓊脂平板初步鑒定：革蘭染色（-），氧化酶（+），三糖鐵瓊脂反應(yīng)為斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、產(chǎn)硫化氫微生物鑒定系統(tǒng)鑒定實驗PCR

確證實驗rpoA

特異基因（+）報告檢出施萬菌

分析（種水平鑒定，可選）圖1 施萬菌分離鑒定流程圖學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

032—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載8 操作步驟樣品類型和處理8.1.1 樣品類型8.1.1.1

臨床樣品：包括糞便、尿液、嘔吐物、痰液、腦脊液、肛拭子、皮膚化膿性病灶等。8.1.1.2

食品樣品：包括乳制品、肉制品、水產(chǎn)制品、即食蛋制品、糧食制品、即食豆制品、即食果蔬制品等預(yù)包裝食品。8.1.1.3

環(huán)境樣品：包括水體、市場各水產(chǎn)或肉類檔口、各超市生鮮類柜臺和餐廳廚房的環(huán)境，包括案板、器具物表、餐具、儲存冰箱或冷庫內(nèi)表面、污水、工作人員手部等多點涂抹樣品。8.1.2 樣品處理8.1.2.1

臨床樣品：以無菌操作稱取待檢樣品

g（mL）[不足

0.5

g（）取其全部]，加入裝有

10mL

施萬菌增菌液的試管中，震蕩混勻。8.1.2.2

食品樣品：以無菌操作取食品樣品

25

g（mL）[不足

25

g（mL）取其全部]，加入裝有

225

施萬菌增菌液的均質(zhì)袋，或放入盛有

225

施萬菌增菌液的無菌錐形瓶中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)

1

~2

，震蕩混勻。8.1.2.3

環(huán)境樣品：環(huán)境物體表面，使用滅菌干燥棉拭子于

10

施萬菌增菌液內(nèi)浸潤后，在物體表面的適當(dāng)部位來回均勻涂抹進行樣品采集，再用滅菌剪刀剪去棉簽手接觸部分，將棉拭子放入增菌液試管中，震蕩混勻。環(huán)境水體樣品量取樣品

50

，加入裝有

施萬菌增菌液的無菌錐形瓶中，震蕩混勻。增菌將樣品勻液置于恒溫生化培養(yǎng)箱，36

±1

18

h

~24

h。分離培養(yǎng)用無菌接種環(huán)取增菌液，劃線接種

TCBS

瓊脂平板，于恒溫培養(yǎng)箱

36

±1

培養(yǎng)

18

h

~24

h。施萬菌在

TCBS

瓊脂培養(yǎng)基上疑似菌落為中等大小、圓形、光滑凸起、綠色不透明，帶或不帶黑色中心。挑取

3

個或以上可疑菌落，劃線接種營養(yǎng)瓊脂平板，于恒溫培養(yǎng)箱

36

±1

18

h

~24

h。初步鑒定8.4.1 革蘭染色鏡檢8.4.2.1

制片：以接種環(huán)取一滴鹽水放于玻片上，挑取營養(yǎng)瓊脂平板上數(shù)個菌落與鹽水混勻，均勻涂布，學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

032—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載自然干燥，玻片在火焰上來回通過

3~4

次，使細菌固定在玻片上。8.4.2.2

1~2

，水洗。8.4.2.3

媒染：加碘液作用

1

后，水洗瀝凈。8.4.2.4

的乙醇無紫色時，立即水洗。8.4.2.5

復(fù)染：用番紅液復(fù)染

1~2

，水洗，用濾紙吸干。8.4.2.6

呈桿狀。8.4.2 氧化酶實驗

s

s

性處理。施萬菌為氧化酶陽性。8.4.3 三糖鐵瓊脂（）實驗以接種針挑取營養(yǎng)瓊脂上的單個菌落，先穿刺接種到

TSI

深層，距管底

3

~5

為止，再從原路退回，在斜面自下而上劃線，于恒溫培養(yǎng)箱

±1

培養(yǎng)

18

h~24

h

觀察結(jié)果。產(chǎn)生黑色沉淀即表明產(chǎn)生了

HS；發(fā)酵乳糖或蔗糖的細菌使整個培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色；只能利用葡萄糖的細菌則斜面變紅，底部仍保持黃色。施萬菌在

TSI

中的反應(yīng)為斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、產(chǎn)硫化氫。微生物自動鑒定系統(tǒng)實驗挑取疑似純菌落，按照微生物自動鑒定系統(tǒng)的要求進行操作，鑒定結(jié)果為施萬菌（Shewanella）或該屬的某個種，如海藻施萬菌（

algaeShewanella

）時，為施萬菌微生物鑒定系統(tǒng)實驗陽性。微生物自動鑒定系統(tǒng)包括全自動生化鑒定儀和飛行時間質(zhì)譜儀。PCR

確證實驗8.6.1 核酸模板制備使用

1

μL

接種環(huán)刮取營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)

18

h

的菌落，懸浮在

200

μL

0.85%滅菌生理鹽水中，充分打散制成菌懸液，于

100

10

；冰浴冷卻后，13000

離心

3

，收集上清液作為

PCR

檢測的模板；所有處理后的

DNA

模板直接用于

PCR

反應(yīng)或暫存于

4

并當(dāng)天進行

PCR

反應(yīng)；否則，應(yīng)在

以下保存?zhèn)溆?1

周內(nèi))。也可用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA，操作方法按照細菌基因組提取試劑盒說明書進行。每次

PCR

反應(yīng)，使用中國疾病預(yù)防控制中心病原微生物菌（毒）種保藏中心（CHPC

CHPC

1.2277（國家病原微生物保藏中心編號：NPRC

1.2.743）作為陽性對照。同時，使用氣單胞菌

CHPC

1.261

或等效標準菌株作為陰性對照，以滅菌去離子水作為空白對照，控制

PCR

體系污染。8.6.2 PCR

反應(yīng)體系9.610×PCR

2.525

2.52.5

dNTPs3.010×2.510×2.5

0.4

2.025.05'→3'

rpoArpoA-27-F93354rpoA-27-R準ｘｗｚｆ．ｂｗｗ學(xué)兔兔ｗ．ｃｏｍ標下載T/CPMA

032—2023準ｘｗｚｆ．ｂｗｗ學(xué)兔兔ｗ．ｃｏｍ標下載使用去離子水將合成的施萬菌屬特異性引物（見表

1）干粉稀釋成

100

儲存液。繼續(xù)配制成

引物工作液

2

，PCR

反應(yīng)體系中引物的終濃度為

0.2

。將

10×PCR

反應(yīng)緩沖液、25

mmol/LMgCl、2.5

dNTPs、滅菌去離子水從

冰箱中取出，融化并平衡至室溫，使用前混勻；5

U/μL

酶在加樣前從

冰箱中取出。每個樣品按照表

2

的加液量配制

μL

反應(yīng)體系。表1 施萬菌

PCR

實驗用引物表2 施萬菌

PCR

體系配制表8.6.3 PCR

擴增條件94

預(yù)變性

10

，然后

30

s，

退火

表1 施萬菌

PCR

實驗用引物表2 施萬菌

PCR

體系配制表8.6.3 PCR

擴增條件后

72

。8.6.4 擴增產(chǎn)物分析PCR

擴增結(jié)束后，取

5

μL

產(chǎn)物上樣于

1

%瓊脂糖凝膠中，在

V

45

，驗證是否為單一條帶并位于相應(yīng)的片段大小位置上。8.6.5 結(jié)果判定rpoA

基因陽性者判定為施萬菌。8.6.6 種水平的鑒定（選做）學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

032—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載見附錄

D

（規(guī)范性）施萬菌種水平的鑒定（

法）。學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

032—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載

附 錄 A（資料性）施萬菌病原學(xué)施萬菌屬（Shewanella

spp.）又稱希瓦氏菌屬，是一類革蘭氏陰性、氧化酶陽性、兼性厭氧、可產(chǎn)

H2S

的海洋性細菌。

研究者根據(jù)

rRNA

序列分析，建議提出一個新的屬，施萬菌屬被正式命名。目前施萬菌屬的成員已超過

70

個種。它們主要分布于海洋和淡水生境，也可分布于腐敗的食物、水生有機質(zhì)以及高鹽、高壓和低溫等極端環(huán)境中。

H2S，氧化酶、明膠酶、過氧化氫酶、硝酸鹽還原反應(yīng)均為陽性，可水解蔗糖、麥芽糖，亞硝酸鹽還原反應(yīng)、陰性，鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)為陽性。基因組的

含量為

。施萬菌在含鹽量為

1%-9%

小時后形成

培養(yǎng)基上呈現(xiàn)鮭魚色。生長于血瓊脂平板上的菌落也有產(chǎn)綠色色素的現(xiàn)象。S.algae）、腐敗施萬菌（S.putrefaciensS.xiamenensis）組織感染。施萬菌引發(fā)感染的途徑，包括職業(yè)性暴露()有施萬菌的海洋生物()感染的風(fēng)險。由于種間表型特征幾乎相同，區(qū)分不同菌種的生化指標有限，很難應(yīng)用于施萬菌種的檢測鑒定。使用的管家基因

rpoA

檢測方法，和基于六個管家基因的施萬菌種水平的

MLSA

鑒定方法?！?42）實驗室中進行，采用B類（UN3373）包裝運輸。非感染性材料的實驗操作在生物安全一級（BSL-1）實驗室中進行。學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

032—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載附 錄 B（規(guī)范性）設(shè)備和材料B.1

冰箱：4

℃~8

℃，

℃，

℃。B.2

恒溫培養(yǎng)箱：

℃±1

℃。B.3

離心機：離心力

g。B.4

天平：感量

0.001

g。B.5

顯微鏡：

倍~

倍，有相差功能。B.6

培養(yǎng)皿：直徑

90

或

60

。B.7

比色管或精密

試紙。B.8

震蕩器。B.9

全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。B.10

飛行時間質(zhì)譜儀。

微量移液器：量程

10

μL、200

μL

和

1000

μL。B.12

無菌刻度移液管：10

mL。B.13

無菌離心管：1.5

、15

和

50

mL。B.14

無菌吸頭：10

μL、200

μL

和

1000

μL。B.15

PCR

管：0.2

。B.16

基因擴增儀。B.17

水平電泳儀：包括電源、電泳槽、膠槽和梳子。B.18

凝膠成像系統(tǒng)。ｚｆ．ｂｗｗ兔ｗ兔學(xué)ｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

032—2023ｚｆ．ｂｗｗ兔ｗ兔學(xué)ｘｗ．ｃｏｍ標準下載附 錄 C（規(guī)范性）培養(yǎng)基和試劑C.1

施萬菌增菌液蛋白胨 10.0

g氯化鈉 30.0

g酵母粉 5.0

g去離子水 1000

將上述成分混合溶解后，校正

至

7.2±0.2，于

℃高壓蒸汽滅菌

15

。C.2

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）瓊脂酵母粉 5.0

g蛋白胨 10.0

g硫代硫酸鈉 10.0

g枸櫞酸鈉 10.0

g牛膽粉 5.0

g牛膽酸鈉 3.0

g蔗糖 20.0

g氯化鈉 10.0

g檸檬酸鐵 1.0

g麝香草酚蘭 0.04

g瓊脂 15.0

g去離子水 1000

至

8.6±0.2

℃左右傾注平板備用。C.3

營養(yǎng)瓊脂蛋白胨 10.0

g氯化鈉 10.0

g牛肉膏 3.0

g瓊脂 15.0

g去離子水 1000

將上述成分混合溶解后，校正

至

7.2±0.2，

℃高壓蒸汽滅菌

。C.4

三糖鐵瓊脂（）蛋白胨 20.0

g．ｂｗｗ學(xué)兔兔ｗｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載T/CPMA

032—2023．ｂｗｗ學(xué)兔兔ｗｚｆｘｗ．ｃｏｍ標準下載牛肉?膏 5.0

g氯化鈉 5.0

g乳糖 10.0

g蔗糖 10.0

g葡萄糖 1.0

g酚紅 0.025

g硫酸亞鐵銨 0.2

g硫代硫酸鈉 0.2

g瓊脂 12.0

g去離子水 1000

除酚紅和瓊脂外，將其它成分加于

去離子水中，攪拌均勻，靜置約

，加熱使完全溶化，冷卻至

左右校正

至

7.4±。另將瓊脂加于

mL

去離子水中，靜置約

10

，加熱使完全溶化。將兩液混合均勻，加入

5%

5

mL，混勻，分裝小號試管，每管約

3

mL。于

121

高壓蒸汽滅菌

或

115

高壓蒸汽滅菌

，制成高層斜面，冷卻后呈桔紅色，放

2

8

條件下備用。C.5

氧化酶試劑二鹽酸四甲基對苯二胺 1.0

g去離子水 100

mL稱取

g

二鹽酸四甲基對苯二胺，加入去離子水少許，充分振搖，待完全溶解后，加去離子水定容至

100

。冰箱內(nèi)避光保存，在

7

天之內(nèi)使用。C.6

5×

電泳緩沖液Tris

堿 54.0

g硼酸 27.5

gNa2EDTA·2HO 3.72

g去離子水 1000

將上述成分混合溶解，室溫保存。瓊脂糖凝膠電泳時使用濃度為

0.5×。105'→3'擴增序列長度(bp)gyrAgyrA-164FTGAAGAACGATTGGAACAA66456gyrA-827RgyrBUP-1125658UP-2rinfBinfB-1426F83056infB-2255RrecN-415F86354recN-1277RGGTTGTAAAGGTTGCCCTGGGTTrpoArpoA-83F75156rpoA-833RtopAtopA-70F86060topA-929R準ｏｍ標．ｃ學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ下載T/CPMA

032—2023準ｏｍ標．ｃ學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ下載附 錄 D（規(guī)范性）施萬菌種水平的鑒定（

法）D.1

核酸模板制備按照

8.6.1

進行操作。D.2

反應(yīng)體系管家基因的上下游引物見表

D.1。PCR

反應(yīng)體系按照

8.6.2

進行操作。表

D.1

施萬菌

管家基因引物D.3

擴增條件94

預(yù)變性

10

，然后

94

s，~60

退火

30

s，表

D.1

施萬菌

管家基因引物D.3

擴增條件環(huán)，最后

10

。對于上述

6

對管家基因，PCR

擴增的退火溫度見表

D.1。D.4

擴增產(chǎn)物分析PCR

擴增結(jié)束后，取

5

μL

產(chǎn)物于

1%瓊脂糖凝膠中，在

120

V

電壓下電泳

45

，驗證是否為單一條帶并位于相應(yīng)的片段大小位置上。剩余產(chǎn)物使用相應(yīng)管家基因引物進行雙向測序。D.5

MLSA

進化樹將測序獲得的實驗菌株

、、、、

和

基因分別對應(yīng)大腸桿菌

56-1455、247-744、、1519-2181、565-1200、139-756

和

106-768

的基因位點截齊，然后將六個管家基因序列按

-gyrB--recN-rpoA-topA

順序依次串聯(lián)。并以施萬