23.1 免疫細(xì)胞的分離純化講解

第二十三章

免疫細(xì)胞及其功能檢驗(yàn)技術(shù)知識(shí)目標(biāo)1.掌握：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞及其亞群的分離純化；T細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志和功能檢測(cè)方法；B細(xì)胞功能檢測(cè)方法和原理；NK細(xì)胞的表面標(biāo)志。2.熟悉：NK細(xì)胞功能的檢測(cè)方法和原理。3.了解：中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)方法和原理。能力目標(biāo)掌握密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的操作流程；熟悉FCM和磁珠分離法分離淋巴細(xì)胞及其亞群的操作方法。思政-素質(zhì)目標(biāo)責(zé)任心、質(zhì)控、生物安全意識(shí)、臨床免疫學(xué)思維教學(xué)目標(biāo)目錄免疫細(xì)胞的分離與純化一淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)二吞噬細(xì)胞功能檢測(cè)三免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等。通過(guò)分離、純化免疫細(xì)胞及其亞群，并對(duì)其數(shù)量和功能測(cè)定，可以判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)，對(duì)指導(dǎo)臨床實(shí)踐和科學(xué)研究具有重要意義。前言免疫細(xì)胞的分離方法很多，主要根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志、理化性狀和細(xì)胞功能等特征。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、所分離的目的細(xì)胞群種類、數(shù)量和純度等要求選擇分離方法。所用的方法應(yīng)力求操作簡(jiǎn)便、盡量保持細(xì)胞活性兼顧細(xì)胞純度和獲得率。免疫細(xì)胞的分離與純化一一、白細(xì)胞的分離（一）自然沉降法加抗凝血于試管中室溫或37℃中靜置（30-60min）分層結(jié)果示意圖（二）高分子聚合物沉降法抗凝血與等量3%明膠或6%右旋糖酐溶液混勻室溫或37℃中靜置（30～60min）分層結(jié)果與自然沉降法類似優(yōu)點(diǎn)：速度快、得率高不足：白細(xì)胞黏性增加二、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）主要是指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。PBMC是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的細(xì)胞群PBMC也是T、B細(xì)胞分離純化的細(xì)胞來(lái)源。細(xì)胞種類密度紅細(xì)胞1.093白細(xì)胞1.092淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞1.075~1.090血小板1.030~1.035人外周血中各類血細(xì)胞密度常用的分離液：Ficoll液和Percoll液尤以密度為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分層液（Ficoll液）最常用。（一）

Ficoll分離法注意：溫度以20℃最適宜，超過(guò)25℃影響細(xì)胞得率（二）

Percoll分層液法連續(xù)密度梯度分離液（Percoll液+PBS，離心）加入PBMC懸液或抗凝全血1000×g離心20min結(jié)果示意圖三、淋巴細(xì)胞的純化及亞群的分離采用Ficoll和Percoll分離法獲得的細(xì)胞懸液成分仍然較為復(fù)雜、均一性不佳。通常需要進(jìn)一步分離純化淋巴細(xì)胞及其亞群。分離原理主要基于細(xì)胞的表面標(biāo)志和功能等性質(zhì)。淋巴細(xì)胞及其亞類的分離純化是免疫學(xué)檢驗(yàn)與研究的重要基礎(chǔ)技術(shù)。（一）淋巴細(xì)胞的純化去除紅細(xì)胞：低滲裂解法、氯化銨裂解法。去除血小板：多次洗滌離心法、胎牛血清梯度離心法。去除單核細(xì)胞：黏附法、羧基鐵吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法（二）淋巴細(xì)胞的分離E花環(huán)沉降法該法簡(jiǎn)便易行，主要用于T細(xì)胞的分離PBMC懸液與SRBC混合Ficoll法密度梯度離心收集管底細(xì)胞并低滲裂解（二）淋巴細(xì)胞的分離尼龍棉分離法該法簡(jiǎn)單快速，可分離T細(xì)胞和B細(xì)胞PBMC懸液加入尼龍棉柱37℃中靜置1～2小時(shí)預(yù)熱的含小牛血清培養(yǎng)液洗脫獲得T細(xì)胞冷培養(yǎng)液邊沖洗邊擠壓獲得B細(xì)胞（二）淋巴細(xì)胞的分離免疫磁珠分離法（二）淋巴細(xì)胞的分離流式細(xì)胞術(shù)分離法該法快速、細(xì)胞純度和獲得率高，可分離各種淋巴細(xì)胞及其亞群。四、吞噬細(xì)胞的分離吞噬細(xì)胞包括兩類：一類是大吞噬細(xì)胞即單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（包括血液中的單核細(xì)胞以及組織器官中的巨噬細(xì)胞）；另一類是小吞噬細(xì)胞，即中性粒細(xì)胞。分離原理：主要根據(jù)其表面標(biāo)志和生物學(xué)特性。（一）單核細(xì)胞的分離Percoll密度梯度分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法（常用方法）免疫磁珠分離法：分選CD14+細(xì)胞（常用方法）黏附法黏附法會(huì)影響單核細(xì)胞的功能，僅適用于去除單核細(xì)胞。（二）巨噬細(xì)胞的分離斑蝥敷貼法：（用于分離人巨噬細(xì)胞）

操作要點(diǎn)：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的濾紙?zhí)笤谇氨蹆?nèi)側(cè)皮膚，4~5小時(shí)后見皮膚局部充血，48小時(shí)后出現(xiàn)水泡，吸取滲出液（主要為巨噬細(xì)胞）、離心洗滌。腹腔滲出液分離法：（用于分離動(dòng)物巨噬細(xì)胞）

操作要點(diǎn)：少量液體石蠟注入動(dòng)物腹腔內(nèi)，3~4天后沖洗出腹腔滲出液（70%~80%為巨噬細(xì)胞）。（三）中性粒