【課件】紫外分光光度法

島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司山東培訓(xùn)基地張崢Tel/p>

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suweifu@163.com島津UV-Vis分光光度計(jì)培訓(xùn)售后服務(wù)機(jī)構(gòu)聯(lián)系方式免費(fèi)電話： 800-810-0439

400-650-0439(手機(jī))部件(島津技邇)： 800-820-7730北京：分析中心： 修技術(shù)： 海：分析中心： 修技術(shù)： 州：分析中心： 修技術(shù)： Vmini1240UV1750UV1800UV2450/2550島津紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)系列UV3600SolidSpec-3700(DUV)島津紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)系列紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)理論培訓(xùn)

(UltravioletandVisibleSpectrophotometry,UV-Vis)紫外-可見(jiàn)吸收光譜吸收光譜的測(cè)量-----Lambert-Beer

定律紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)儀器組成分析條件選擇UV-Vis分光光度法的應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的維護(hù)和保養(yǎng)UV-Vis方法是分子光譜方法，它利用分子對(duì)外來(lái)輻射的吸收特性。UV-Vis涉及分子外層電子的能級(jí)躍遷；光譜區(qū)在160~780nm.UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光譜(UV)為四大波譜之一，是鑒定許多化合物，尤其是有機(jī)化合物的重要定性工具之一。紫外-可見(jiàn)吸收光譜電磁波譜g-X-射線紫外可見(jiàn)紅外微波無(wú)線電2004008003200(nm)波長(zhǎng)真空紫外近紅外核磁共振波長(zhǎng)越短，能量越高基態(tài)

E0激發(fā)態(tài)

E1DE=E1-E0=hn能量激發(fā)e能量差DE一、分子吸收光譜的形成過(guò)程：運(yùn)動(dòng)的分子外層電子--------吸收外來(lái)外來(lái)輻射------產(chǎn)生電子能級(jí)躍遷-----分子吸收譜能級(jí)組成：除了電子能級(jí)(Electronenergylevel)外，分子吸收能量將伴隨著分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，即同時(shí)將發(fā)生振動(dòng)(Vibration)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)(Rotation)能級(jí)的躍遷！據(jù)量子力學(xué)理論，分子的振-轉(zhuǎn)躍遷也是量子化的或者說(shuō)將產(chǎn)生非連續(xù)譜。因此，分子的能量變化

E為各種形式能量變化的總和：其中

Ee最大：1-10eV;

Ev次之：0.05-1eV;

Er最?。?/p>

0.05eV能量振動(dòng)躍遷轉(zhuǎn)動(dòng)躍遷v1v1v0543110電子躍遷E1E0v0v1v1可見(jiàn)，電子能級(jí)間隔比振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間隔大1~100個(gè)數(shù)量級(jí)，在發(fā)生電子能級(jí)躍遷時(shí)，伴有振-轉(zhuǎn)能級(jí)的躍遷，形成帶狀光譜。

二、分子吸收光譜躍遷類(lèi)型各軌道能級(jí)高低順序：

n

*

*；可能的躍遷類(lèi)型：

-

*；-

*；-

*；n-*；-

*；n-*

-

*：C-H共價(jià)鍵，如CH4（115nm）；C-C鍵，如C2H6(135nm)，處于真空紫外區(qū)；

-

*:和

-

*躍遷：盡管所需能量比上述

-

*躍遷能量小，但波長(zhǎng)仍處于真空紫外區(qū)；n-*：含有孤對(duì)電子的分子，如H1O(167nm)；CH3OH(184nm)；CH3Cl(173nm);CH3I(158nm)；(CH3)1S(119nm)；(CH3)1O(184nm)CH3NH1(115nm)；(CH3)3N(117nm)，可見(jiàn)，大多數(shù)波長(zhǎng)仍小于200nm，處于近紫外區(qū)。以上四種躍遷都與成鍵和反鍵軌道有關(guān)（

-

*，-

*，-

*和n-*），躍遷能量較高，這些躍遷所產(chǎn)生的吸收譜多位于真空紫外區(qū)，因而在此不加討論。只有

-

*和n-*兩種躍遷的能量小，相應(yīng)波長(zhǎng)出現(xiàn)在近紫外區(qū)甚至可見(jiàn)光區(qū)，且對(duì)光的吸收強(qiáng)烈，是我們研究的重點(diǎn)。幾個(gè)概念：生色團(tuán)（Chromogenesisgroup）：分子中含有非鍵或

鍵的電子體系，能吸收外來(lái)輻射時(shí)并引起n-*

和

-

*躍遷，可產(chǎn)生此類(lèi)躍遷或吸收的結(jié)構(gòu)單元，稱(chēng)為生色團(tuán)。助色團(tuán)（Auxochromousgroup）：含有孤對(duì)電子，可使生色團(tuán)吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)并提高吸收強(qiáng)度的一些官能團(tuán)，稱(chēng)之為助色團(tuán)。紅移或藍(lán)移（Redshiftorblueshift）：在分子中引入的一些基團(tuán)或受到其它外界因素影響，吸收峰向長(zhǎng)波方向（紅移）或短波方向移動(dòng)（藍(lán)移）的現(xiàn)象。吸收光譜的測(cè)量

Lambert-Beer

定律入射光I0透射光I光程長(zhǎng)b透射率

T%=II0×100%一、透射率T%

當(dāng)入射光波長(zhǎng)一定時(shí)，待測(cè)溶液的吸光度A與其濃度和液層厚度成正比，即k為比例系數(shù)，與溶液性質(zhì)、溫度和入射波長(zhǎng)有關(guān)。

當(dāng)濃度以g/L表示時(shí)，稱(chēng)k為吸光系數(shù)，以a表示，即

當(dāng)濃度以mol/L表示時(shí)，稱(chēng)k為摩爾吸光系數(shù)，以

表示，即

比a更常用。

越大，表示方法的靈敏度越高。

與波長(zhǎng)有關(guān)，因此，

常以

表示。二、Lambert-Beer

定律三、偏離Lambert-Beer定律的因素樣品吸光度A與光程b總是成正比。但當(dāng)b一定時(shí)，A與c并不總是成正比，即偏離Lambert-Beer定律！這種偏離由樣品性質(zhì)和儀器決定。樣品性質(zhì)影響待測(cè)物高濃度—吸收質(zhì)點(diǎn)間隔變小—質(zhì)點(diǎn)間相互作用—對(duì)特定輻射的吸收能力發(fā)生變化—

變化；試液中各組份的相互作用，如締合、離解、光化反應(yīng)、異構(gòu)化、配體數(shù)目改變等，會(huì)引起待測(cè)組份吸收曲線的變化；溶劑的影響：對(duì)待測(cè)物生色團(tuán)吸收峰強(qiáng)度及位置產(chǎn)生影響；膠體、乳狀液或懸浮液對(duì)光的散射損失。

儀器因素儀器因素包括光源穩(wěn)定性以及入射光的單色性等。入射光的非單色性：不同光對(duì)所產(chǎn)生的吸收不同，可導(dǎo)致測(cè)定偏差。譜帶寬度與狹縫寬度：“單色光”僅是理想情況，經(jīng)分光元件色散所得的“單色光”實(shí)際上是有一定波長(zhǎng)范圍的光譜帶(即譜帶寬度)。單色光的“純度”與狹縫寬度有關(guān)，狹縫越窄，它所包含的波長(zhǎng)范圍越小，單色性越好。紫外-可見(jiàn)光度計(jì)儀器組成UV示意圖光源單色器樣品池檢測(cè)器紫外-可見(jiàn)光度計(jì)儀器組成光源基本要求：足夠光強(qiáng)、穩(wěn)定、連續(xù)輻射且強(qiáng)度隨波長(zhǎng)變化小。碘鎢燈：300~3300nm，多用在可見(jiàn)及近紅外光譜；氘燈：160~400nm，多用在紫外區(qū)。單色器(Monochromator)與原子吸收光度儀不同，在UV-Vis光度計(jì)中，單色器通常置于吸收池的前面?。煞乐箯?qiáng)光照射引起吸收池中一些物質(zhì)的分解）樣品室(Cell，Container)：用于盛放樣品?？捎檬⒒虿Ａ煞N材料制作，前者適于紫外區(qū)和可見(jiàn)光區(qū)；后者只適于可見(jiàn)光區(qū)。有些透明有機(jī)玻璃亦可用作吸收池。檢測(cè)器：硅光電池、PMT、PDAUV2550光路圖UV2450光路圖UV3600光路圖分析條件選擇由于光源不穩(wěn)定性、讀數(shù)不準(zhǔn)等帶來(lái)的誤差。當(dāng)分析高濃度的樣品時(shí)，誤差更大。由L-B定律：

微分后得：

將上兩式相比，并將dT和dc分別換為

T和

c，得：當(dāng)相對(duì)誤差

c/c最小時(shí)，求得T=0.368或A=0.434。即當(dāng)A=0.434時(shí)，吸光度讀數(shù)誤差最??！通?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)溶液濃度或改變光程b來(lái)控制A的讀數(shù)在0.15~1.00范圍內(nèi)。

一、儀器測(cè)量條件二、反應(yīng)條件選擇(顯色法)顯色劑的選擇原則：使配合物吸收系數(shù)

最大、選擇性好、組成恒定、配合物穩(wěn)定、顯色劑吸收波長(zhǎng)與配合物吸收波長(zhǎng)相差大等。顯色劑用量：配位數(shù)與顯色劑用量有關(guān)；在形成逐級(jí)配合物，其用量更要嚴(yán)格控制。溶液酸度：配位數(shù)和水解等與pH有關(guān)。顯色時(shí)間、溫度、放置時(shí)間等。測(cè)定波長(zhǎng)的選擇三、參比液選擇溶劑參比：試樣組成簡(jiǎn)單、共存組份少（基體干擾少）、顯色劑不吸收時(shí)，直接采用溶劑（多為蒸餾水）為參比；試劑參比：當(dāng)顯色劑或其它試劑在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收時(shí)，采用試劑作參比（不加待測(cè)物）；試樣參比：如試樣基體在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收，但不與顯色劑反應(yīng)時(shí)，可以試樣作參比（不能加顯色劑）。四、干擾消除控制酸度：

配合物穩(wěn)定性與pH有關(guān)，可以通過(guò)控制酸度提高反應(yīng)選擇性，副反應(yīng)減少，而主反應(yīng)進(jìn)行完全。如在0.5MH2SO4介質(zhì)中，雙硫腙與Hg2+生成穩(wěn)定有色配合物，而與Pb2+、Cu2+、Ni3+、Cd2+等離子生成的有色物不穩(wěn)定。選擇掩蔽劑合適測(cè)量波長(zhǎng)干擾物分離導(dǎo)數(shù)光譜及雙波長(zhǎng)技術(shù)UV-Vis分光光度法的應(yīng)用一、定性分析不同物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同或者說(shuō)其分子能級(jí)的能量(各種能級(jí)能量總和)或能量間隔各異，因此不同物質(zhì)將選擇性地吸收不同波長(zhǎng)或能量的外來(lái)輻射，這是UV-Vis定性分析的基礎(chǔ)。定性分析具體做法是讓不同波長(zhǎng)的光通過(guò)待測(cè)物，經(jīng)待測(cè)物吸收后，測(cè)量其對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度(吸光度A)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，輻射波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)作圖，得到該物質(zhì)的吸收光譜或吸收曲線，據(jù)吸收曲線的特性(峰強(qiáng)度、位置及數(shù)目等)研究分子結(jié)構(gòu)。

-胡羅卜素咖啡因阿斯匹林丙酮幾種化合物的分子吸收光譜圖Woodward-Fieser規(guī)則制作試樣的吸收曲線并與標(biāo)準(zhǔn)紫外光譜對(duì)照；利用Woodward-Fieser和Scott經(jīng)驗(yàn)規(guī)則求最大吸收波長(zhǎng)。

即，當(dāng)通過(guò)其它方法獲得一系列可能的分子結(jié)構(gòu)式后，可通過(guò)此類(lèi)規(guī)則估算最大吸收波長(zhǎng)并與實(shí)測(cè)值對(duì)比。Woodward-Fieser規(guī)則估算實(shí)例：二、定量分析單組份定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法（略）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法：該法是標(biāo)準(zhǔn)曲線法的簡(jiǎn)化，即只配制一個(gè)濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測(cè)量其吸光度，求出吸收系數(shù)k，然后由Ax=kcx求出cx該法只有在測(cè)定濃度范圍內(nèi)遵守L-B定律，且cx與cs大致相當(dāng)時(shí)，才可得到準(zhǔn)確結(jié)果。多組分定量方法由于吸光度具有加合性，故可在同一試樣中測(cè)定多個(gè)組份。設(shè)試樣中有兩組份X和Y，將其顯色后，分別繪制吸收曲線，會(huì)出現(xiàn)如圖所示的三種情況：

圖a)：X,Y組份最大吸收波長(zhǎng)不重迭，相互不干擾，可以按兩個(gè)單一組份處理。

圖b)和c)：X,Y相互干擾，此時(shí)可通過(guò)解聯(lián)立方程組求得X和Y的濃度：

其中，X,Y組份在波長(zhǎng)

1和

2處的摩爾吸光系數(shù)

可由已知濃度的X,Y純?nèi)芤簻y(cè)得。解上述方程組可求得cx及cy。

雙波長(zhǎng)法—等吸收點(diǎn)法當(dāng)混合物的吸收曲線重迭時(shí)，如右下圖所示，可用雙波長(zhǎng)法來(lái)測(cè)定。

具體做法：將a視為干擾組份，現(xiàn)要測(cè)定b

組份

a)

分別繪制各自的吸收曲線；

b)

畫(huà)一平行于橫軸的直線分別交于a組份曲線兩點(diǎn)，并與b組分相交；

c)

以交于a上一點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)

2（259.7nm）為參比波長(zhǎng)，另一點(diǎn)對(duì)應(yīng)的為測(cè)量波長(zhǎng)

1（289nm），并對(duì)混合液進(jìn)行測(cè)量，得到：

A1=A1a+A1b+A1s

A2=A2a+A2b+A2s

若兩波長(zhǎng)處的背景吸收相同，即A1s=A2s

二式相減，得：

A=(A1a-A2a)+(A1b-A2b)

由于a組份在兩波長(zhǎng)處的吸光度相等，

因此：

A=(A1b-A2b)=(1b-2b)lcb

從中可求出cb.同理，可求出ca.鹽酸普卡因含量測(cè)定導(dǎo)數(shù)光譜法定義：將吸光度信號(hào)轉(zhuǎn)化為對(duì)波長(zhǎng)的導(dǎo)數(shù)信號(hào)的方法。導(dǎo)數(shù)光譜是解決干擾物質(zhì)與被子測(cè)物光譜重疊，消除膠體等散射影響和背景吸收，提高光譜分辨率的一種數(shù)據(jù)處理技術(shù)。原理：

已知，對(duì)波長(zhǎng)求一階導(dǎo)數(shù)，得

可見(jiàn)，一階導(dǎo)數(shù)信號(hào)與濃度成正比。

同樣可得到二階、三階….n階導(dǎo)數(shù)信號(hào)亦與濃度成正比。三、積分球及其應(yīng)用透射、反射測(cè)定；分析混濁、不透明、固體樣品?；鞚?、不透明樣品中的散射表面粗糙樣品的漫反射固體樣品厚度對(duì)焦點(diǎn)位置的影響SDS:鏡反射D:漫反射光原理樣品樣品參比光束標(biāo)準(zhǔn)白板標(biāo)準(zhǔn)白板樣品光束實(shí)例：宇航服布料的抗紫外測(cè)定布料在紫外可見(jiàn)近紅外波段的透過(guò)與反射曲線部分其他使用積分球的測(cè)定例：《使用積分球測(cè)定樣品的鏡反射和漫反射光譜》《紫外分光光度計(jì)和積分球測(cè)定鏡頭類(lèi)樣品的透過(guò)率》《紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定色度鑒定書(shū)畫(huà)真?zhèn)巍贰蹲贤饪梢?jiàn)分光光度計(jì)和積分球附件測(cè)定太陽(yáng)能鍍膜材料的透射率、反射率和霧度》《紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定紡織品的紫外防護(hù)系數(shù)》《島津UV3600測(cè)定平板型太陽(yáng)能集熱器的太陽(yáng)吸收比及透射比》注：選自島津公司應(yīng)用數(shù)據(jù)集相對(duì)鏡反射測(cè)定分析表面光滑樣品四、5度入射角鏡反射附件及其應(yīng)用原理θθ標(biāo)準(zhǔn)鏡樣品入射光檢測(cè)器GB/T2680-94建筑玻璃、可見(jiàn)光透射比、太陽(yáng)光直接透射比、太陽(yáng)能總透射比、紫外線透射比及有關(guān)窗玻璃參數(shù)的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)要求測(cè)定光譜反射比時(shí)，配鏡面反射裝置計(jì)算太陽(yáng)能總透射比，遮蔽系數(shù)需要用到太陽(yáng)光直接反射比實(shí)例：建筑玻璃參數(shù)測(cè)定部分其他使用5度入射角鏡反射附件的測(cè)定例：《鏡反射附件和日射透射率測(cè)定軟件測(cè)定汽車(chē)玻璃貼膜》注：選自島津公司應(yīng)用數(shù)據(jù)集五、絕對(duì)反射附件及其應(yīng)用絕對(duì)鏡反射測(cè)定分析表面光滑樣品原理入射光測(cè)定光路反射光測(cè)定光路樣品M2M2’M3M3’M1檢測(cè)器入射光入射角和偏振偏光器473nm的反射率幾乎

0%

充分透射473nm光實(shí)例：輸出反射鏡側(cè)

AR膜輸出鏡諧振腔激光激發(fā)光LD（激光二極管）六、其他附件具塞比色皿不同光程長(zhǎng)比色皿半微量比色皿微量比色皿6聯(lián)池架在樣品一側(cè)最多可安放6個(gè)10mm方形池微量池帶光闌池架8/16聯(lián)微量多聯(lián)池架常溫/恒溫(10~60℃)可選恒溫池架5~90℃恒溫4聯(lián)池架5~90℃NTTP2200恒溫水循環(huán)裝置5~80℃電子冷熱式恒溫池架7~60℃無(wú)需恒溫水槽和冷卻循環(huán)水6聯(lián)電子冷熱式池定位裝置16~60℃無(wú)需恒溫水槽和冷卻循環(huán)水電子冷熱式單池架S17000~110℃升/降溫程序控制需要冷卻水半自動(dòng)進(jìn)樣器組件蠕動(dòng)泵方式可搭配標(biāo)準(zhǔn)型、3次通過(guò)型、恒溫型，超微量型流通池半自動(dòng)注射進(jìn)樣器注射泵方式常/恒溫可選自動(dòng)樣品轉(zhuǎn)換器ASC5與半自動(dòng)進(jìn)樣器組合，構(gòu)成多溶液樣品測(cè)定系統(tǒng)5/10mm微量流通池連續(xù)測(cè)定諸如色譜柱洗脫液液相色譜用流通池可作高效液相色譜儀的UV/Vis檢測(cè)器十字形流通池監(jiān)控場(chǎng)合光程1~15mm可調(diào)七、選配軟件色彩測(cè)定軟件計(jì)算色彩值膜厚計(jì)算軟件 計(jì)算薄膜膜厚日射透射率/反射率軟件 日射透射率/反射率計(jì)算紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的維護(hù)與保養(yǎng)一、環(huán)境要求使用工作溫度：15～35℃，濕度：45～80%，如果溫度高于30℃，則濕度必須小于70%避免日光直射避免震動(dòng)避免強(qiáng)磁場(chǎng)，電場(chǎng)遠(yuǎn)離腐蝕性氣體，并避免置于任何可能導(dǎo)致紫外區(qū)吸收的含有機(jī)/無(wú)機(jī)試劑氣體的區(qū)域避免臟污、多塵環(huán)境二、工作臺(tái)要求可承受壓力35Kg+25Kg（PC）最小尺寸：長(zhǎng)：1120mm，寬：710mm，高：520mm三、電源要求供電電壓：100/120/220/230/240V交流±5%50/60Hz功率消耗：約190VA保險(xiǎn)絲使用：100-120V供電，5A；220-240V供電，3.15A安裝地點(diǎn)具備可靠的儀器接地端子D2燈WI燈四、光源更換操作時(shí),必須等待至光源冷卻,約20分鐘光源性能WI燈更換時(shí)，帶上干凈手套，先板開(kāi)碘鎢燈的彈簧架，再按圖示方向旋轉(zhuǎn)彈簧片，以便WI退出。安裝時(shí)相反。安裝時(shí)避免WI燈窗口污染。D2燈更換時(shí)，帶上干凈手套，拔出舊燈，把握新燈窗口背部，將新燈插入燈插座。安裝時(shí)避免D2燈窗口污染。保險(xiǎn)絲座保險(xiǎn)絲電源轉(zhuǎn)換器五、保險(xiǎn)絲更換關(guān)閉電源，拔離儀器電源線。如圖，用螺絲批撥開(kāi)保險(xiǎn)絲座外蓋，取出保險(xiǎn)絲座。更換不良保險(xiǎn)絲，注意使用適當(dāng)規(guī)格保險(xiǎn)絲（3.15A適用于230V）。更換后，推回保險(xiǎn)絲座，注意箭