酶組織化學總論

關(guān)于酶組織化學總論一.概述酶是生物體內(nèi)具有催化作用的特殊蛋白質(zhì)高效性103-106倍專一性低反應(yīng)條件易變性失活降低生化反應(yīng)的反應(yīng)活化能第2頁,共33頁，2024年2月25日，星期天酶活性的檢測方法廣義上說，任何一種可以測定反應(yīng)物變化速度的分析技術(shù)，都可用來測定酶活性容量法（量氣法）比色法與分光光度法熒光法與同位素法離子選擇電極法，旋光法分子生物學，免疫化學法等第3頁,共33頁，2024年2月25日，星期天酶的組織化學

利用細胞內(nèi)的酶具有催化底物的特性，并通過顯色反應(yīng)在切片或涂片上顯示組織或細胞中內(nèi)源性酶的活性及其定位的方法第4頁,共33頁，2024年2月25日，星期天酶組織化學發(fā)展歷史1868年Klebs組化1939年Takamatsu、Gomori堿性磷酸酶1940-1960年電鏡酶組織化學1955年Scheldon酸性磷酸酶免疫酶組織化學1970年Sternberger酶標抗體法目前，用酶組織化學方法能顯示的酶已達100余種第5頁,共33頁，2024年2月25日，星期天酶的種類1.氧化還原酶2.轉(zhuǎn)移酶3.水解酶4.裂解酶5.異構(gòu)酶6.合成酶第6頁,共33頁，2024年2月25日，星期天二.酶組織化學反應(yīng)的基本知識酶的特性酶的定位酶組織化學的基本原理第7頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（一）酶的特性水溶性，易擴散，難溶或不溶于有機溶劑有機溶劑不同程度降低酶的活性易受溫度影響，對熱耐受性弱對干燥耐受性強第8頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（二）酶的定位酶在細胞內(nèi)或超微結(jié)構(gòu)中存在的特定部位5‘-核苷酸酶——漿膜

ATPase——肌球蛋白細胞膜線粒體第9頁,共33頁，2024年2月25日，星期天(三）酶組化的基本條件同時保存結(jié)構(gòu)和酶的活性保存酶的定位，防止酶的擴散或移位保證反應(yīng)產(chǎn)物的特異性*影響酶活性的因素：溫度PH值抑制劑激活劑第10頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（四）原理及一般原則第11頁,共33頁，2024年2月25日，星期天1.基本原理

細胞內(nèi)的酶催化分解合適的底物，生成中間產(chǎn)物（即初級反應(yīng)產(chǎn)物）然后其中之一再與輔助物（或捕捉劑）反應(yīng)，生成有色不溶性的終反應(yīng)產(chǎn)物該反應(yīng)產(chǎn)物沉積在原位，以顯示酶的存在第12頁,共33頁，2024年2月25日，星期天第一反應(yīng)：酶促反應(yīng)

底物初級反應(yīng)產(chǎn)物（PRP）第二反應(yīng)：捕捉反應(yīng)

PRP+捕捉劑終反應(yīng)產(chǎn)物（FRP）酶第13頁,共33頁，2024年2月25日，星期天*PRP彌散：1.底物在酶催化下水解的速度2.PRP在緩沖液中的彌散系數(shù)3.PRP與輔助物反應(yīng)的速度應(yīng)選擇合適的底物和輔助物,減少彌散捕捉劑的濃度（<1mg/ml）第14頁,共33頁，2024年2月25日，星期天2.一般原則對組織處理,制片過程不能影響酶的活性及分布所選底物和輔助物必須迅速,同步穿透入組織和細胞中所選底物最好只能被一種酶催化分解所選輔助物不影響細胞內(nèi)酶的活性,不影響其他反應(yīng)試劑的穿透性PRP必須迅速與輔助物反應(yīng),FRP為水不溶性的有色穩(wěn)定產(chǎn)物所有參與反應(yīng)的試劑均不能與其他成分吸附或結(jié)合第15頁,共33頁，2024年2月25日，星期天(五)酶組織化學的主要步驟1.酶的固定（fixation）2.酶的特異性反應(yīng)（specificreaction）3.在最適條件下,酶反應(yīng)產(chǎn)物的沉著（precipitation）4.使沉著物具有可見性（visualization）組織/細胞制作切片酶反應(yīng)（孵育）顯色封片鏡檢第16頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（六）各步驟注意問題檢測方法的選擇酶的保存與固定

一般新鮮組織快速冷凍,冰凍切片-70℃長期保存固定劑1-4%多聚甲醛,福爾馬林,戊二醛固定時間固定方法:浸泡固定灌流固定固定溫度:0—4℃第17頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（六）各步驟注意問題3.切片制作:切片厚度<40um4.緩沖液選擇緩沖液用于A.配置固定液

B.漂洗液

C.配置酶反應(yīng)孵育液選擇緩沖液應(yīng)注意

A.不能減弱目標酶的活性B.不能含有與捕捉機制相同的物質(zhì)

C.注意漂洗用緩沖液的滲透壓

D.漂洗用緩沖液原則上與固定液配置的緩沖液相同第18頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（六）各步驟注意問題5.孵育反應(yīng)A.孵育液配置

B.孵育的溫度和時間:37℃15-30minC.切片孵育法-切片孵育-漂浮孵育第19頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（六）各步驟注意問題6.酶特異性對照實驗用酶活性抑制劑采用無底物的孵育液過固定或加熱用針對目標酶的激活劑改變孵育液底物選擇最適PH酶細胞內(nèi)的定位差異第20頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（六）各步驟注意問題7.孵育后操作光鏡:

酶孵育后進行后固定脫水封片,鏡檢電鏡:

孵育后,后固定脫水超薄切片后染色電鏡檢查第21頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（六）各步驟注意問題8.人為產(chǎn)物及其原因酶或與檢測有關(guān)物質(zhì)的擴散最終反應(yīng)產(chǎn)物的擴散吸附現(xiàn)象反應(yīng)陰性第22頁,共33頁，2024年2月25日，星期天三.顯示酶的組織化學方法（一）金屬離子沉淀法一般用于顯示磷酸酶第23頁,共33頁，2024年2月25日，星期天1.鈣鈷法β-甘油磷酸鈉磷酸酯+Ca++磷酸鈣

磷酸鈷硫化鈷（黑色沉淀）

酶底物PRP（磷酸）+某金屬金屬顯色與底物混合液中置換某金屬離子結(jié)合AKPCo++硝酸鈷硫化胺酶第24頁,共33頁，2024年2月25日，星期天2.Gomori硝酸鉛法β-甘油磷酸鈉磷酸酯+鉛磷酸鉛

硫化鉛（黑色沉淀）酶底物PRP（磷酸）顯色反應(yīng)與底物混合液中金屬離子結(jié)合ACP硫化胺酶直接沉著第25頁,共33頁，2024年2月25日，星期天

（二）偶氮偶聯(lián)法（偶氮色素法）1.原理底物混合液PRP與不溶性重氮鹽結(jié)合偶氮色素2.方法同時偶聯(lián)法后偶聯(lián)法酶偶氮偶聯(lián)第26頁,共33頁，2024年2月25日，星期天3.常用底物萘酚AS-BI萘酚AS-D

萘酚AS-MX萘酚AS-TR

常用重氮鹽堅牢蘭RR堅牢蘭B堅牢紅RC

堅牢紅TR堅牢紫B

六偶氮副品紅六偶氮新品紅第27頁,共33頁，2024年2月25日，星期天4.舉例

α-萘基磷酸鈉磷酸氫二鈉+α-萘酚

α-萘酚+堅牢蘭偶氮染料沉淀5.應(yīng)用可顯示ALPase,ACPase,酯酶,轉(zhuǎn)肽酶,肽酶,β-葡糖苷酶等磷酸酶第28頁,共33頁，2024年2月25日，星期天(三)聯(lián)苯胺色素法用于顯示過氧化物酶原理:

無色聯(lián)苯胺有色聯(lián)苯胺過氧化物酶,H2O2脫氫

(DAB)聯(lián)苯胺褐第29頁,共33頁，2024年2月25日，星期天(四)四唑鹽法用于顯示氧化酶和脫氫酶原理:四唑鹽或雙四唑鹽氫離子與與底物混合液無色四唑鹽結(jié)合紅色或蘭色的沉淀

脫氫酶+2H被還原第30頁,共33頁，2024年2月25日，星期天常用四唑鹽種類三苯四唑氯化物TTC

藍四唑鹽BT

新四唑鹽NT

四唑氮藍NBT

四氮四唑鹽氯化物TNBT第31頁,共33頁，2024年2月25日，星期天(五)靛藍反應(yīng)原理:底物被酶