NLRP3炎性小體在抑郁癥與糖尿病共病中的作用及其機(jī)制研究

NLRP3炎性小體在抑郁癥與糖尿病共病中的作用及其機(jī)制研究研究背景與目的:隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展日趨迅猛、社會(huì)變革不斷深化以及生活節(jié)奏顯著加快,現(xiàn)代人類所承載的壓力和挑戰(zhàn)空前強(qiáng)大。長(zhǎng)期、慢性的應(yīng)激暴露會(huì)給人們的身心健康帶來巨大威脅,引發(fā)心血管、代謝、消化以及神經(jīng)精神系統(tǒng)的多種慢性疾病。慢性非傳染性疾病已經(jīng)成為構(gòu)成全球疾病負(fù)擔(dān)的主要因素。最近的全球疾病負(fù)擔(dān)研究（Globalburdenofdisease,GBD）榜單中,抑郁障礙和糖尿病高居第三和第四（僅次于未區(qū)分病因的腰痛與頭痛）;在中國(guó),二者則名列第二和第六,且仍呈逐年攀升態(tài)勢(shì)。更緊迫的是,這兩類疾病存在高度共病,嚴(yán)重影響患者的診療進(jìn)程和生活質(zhì)量。近年來,關(guān)于二者之間關(guān)聯(lián)的討論與研究,已然成為了領(lǐng)域內(nèi)的關(guān)注熱點(diǎn),但目前機(jī)制仍不明確。系列研究表明,慢性低活度炎癥反應(yīng)是多種慢性疾病發(fā)生發(fā)展的共同通路,包括IL-1β（Interleukin-1β）在內(nèi)的多種炎性細(xì)胞因子在其中扮演了重要角色。據(jù)報(bào)道,IL-1β可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體應(yīng)激等多種途徑損傷胰島B細(xì)胞,導(dǎo)致后者壞死及凋亡,胰島素分泌減少。再者,IL-1β還能通過促進(jìn)IRS1（Insulinreceptorsubstrate1）蛋白絲氨酸磷酸化,在脂肪組織、肝臟等重要代謝靶器官中誘發(fā)胰島素抵抗,由此參與T1DM和T2DM（Type1/2DiabetesMellitus）的發(fā)病機(jī)制。此外,IL-1β等促炎細(xì)胞因子也可以通過激活HPA（Hypothalamic-pituitary-adrenal）軸、擾亂犬尿氨酸代謝通路、促進(jìn)谷氨酸興奮毒性以及影響神經(jīng)可塑性等途徑,從而參與抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展。臨床研究還證實(shí),抑郁癥患者較健康志愿者血液和腦脊液IL-1β含量升高,且抗抑郁藥物可使其顯著降低。實(shí)際上,IL-1β的成熟活化需要經(jīng)過特異性轉(zhuǎn)化酶（Caspase-1）的剪切,而后者是構(gòu)成炎性小體復(fù)合結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組分。在炎性小體的眾多類型中,NLRP3（NACHT,LRRandPYDdomains-containingprotein3）炎性小體較為重要,在固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮抗感染的作用。然而,如其被過度激活,可能會(huì)引發(fā)系統(tǒng)性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。最近的研究表明,糖尿病患者和抑郁癥患者的循環(huán)血免疫細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)了NLRP3炎性小體的高表達(dá)。包括本課題組在內(nèi)的更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),糖皮質(zhì)激素、高血糖、高血脂等應(yīng)激或代謝危險(xiǎn)信號(hào)能夠激活NLRP3炎性小體。這不禁引發(fā)了我們的思考:以NLRP3炎性小體激活為核心的慢性低活度炎癥反應(yīng),可能正是抑郁癥、糖尿病等應(yīng)激、代謝疾病之間聯(lián)系的關(guān)鍵樞紐。為驗(yàn)證這一推測(cè),我們力求在動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中闡明抑郁癥與糖尿病共病的具體機(jī)制,并據(jù)此提供防治靶點(diǎn),預(yù)期結(jié)果將為抑郁癥與糖尿病的診療貢獻(xiàn)新思路,對(duì)研發(fā)針對(duì)性藥物、探索高效防治策略、減輕疾病負(fù)擔(dān)具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究方法:（一）慢性應(yīng)激誘發(fā)小鼠抑郁樣行為及NLRP3炎性小體的作用采用為期12周的慢性應(yīng)激（本課題為慢性不可預(yù)見性輕度應(yīng)激,CUMS）構(gòu)建小鼠抑郁模型,測(cè)定血清皮質(zhì)酮及炎性因子水平;應(yīng)用炎性小體抑制劑格列本脲及抗抑郁藥物氟西汀進(jìn)行干預(yù),觀察小鼠行為學(xué)及炎癥指標(biāo)改善情況;隨后檢測(cè)模型小鼠海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞激活情況;最后,檢測(cè)海馬區(qū)NLRP3炎性小體的激活及其可能機(jī)制。（二）抑郁模型小鼠共病糖代謝紊亂及NLRP3炎性小體的作用檢測(cè)抑郁模型小鼠的多項(xiàng)糖代謝指標(biāo),評(píng)估胰島素抵抗及胰島分泌功能;檢測(cè)海馬組織的胰島素信號(hào)通路;觀察胰島組織的結(jié)構(gòu)和功能,分析異常的可能原因,并進(jìn)一步檢測(cè)胰島組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況;對(duì)比海馬區(qū)的活化機(jī)制,檢測(cè)胰腺組織NLRP3炎性小體的表達(dá)與激活情況。（三）高糖環(huán)境激活小鼠NLRP3炎性小體在體外構(gòu)建高濃度葡萄糖環(huán)境,觀察小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）NLRP3炎性小體的激活情況;隨后,分別測(cè)定上游第一信號(hào)（TLR4/MyD88/NF-κB）及第二信號(hào)（ROS/PKR/P₂X₇R/TXNIP）等相關(guān)通路的激活情況,并使用特異性信號(hào)通路抑制劑進(jìn)行干預(yù),確認(rèn)高糖活化炎性小體的具體機(jī)制;最后,選取目前最高效的NLRP3炎性小體特異性抑制劑MCC950,對(duì)比分析其對(duì)于高糖模型中炎性小體的抑制作用。（四）糖尿病模型小鼠共病抑郁樣行為及NLRP3炎性小體的作用通過單次大劑量腹腔注射STZ構(gòu)建小鼠糖尿病（高血糖）模型,檢測(cè)模型小鼠抑郁相關(guān)行為學(xué)指標(biāo);應(yīng)用MCC950對(duì)模型小鼠進(jìn)行干預(yù),并評(píng)估干預(yù)效果;測(cè)定模型小鼠血清皮質(zhì)酮及炎性因子水平;最后,對(duì)小鼠海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞及炎性小體激活情況進(jìn)行檢測(cè)與分析。研究結(jié)果:（一）慢性應(yīng)激誘發(fā)小鼠抑郁樣行為1、為期12周的慢性應(yīng)激（CUMS）誘發(fā)小鼠呈現(xiàn)抑郁樣行為,給予格列本脲或氟西汀干預(yù)均能有效緩解。2、CUMS誘發(fā)小鼠HPA軸過度激活及相關(guān)炎癥反應(yīng),格列本脲可顯著改善。3、CUMS誘發(fā)海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活,格列本脲及氟西汀干預(yù)效果不明顯;星形膠質(zhì)細(xì)胞未見明顯改變。4、CUMS可能通過上調(diào)TXNIP的表達(dá),誘發(fā)海馬區(qū)NLRP3炎性小體活化及IL-1β產(chǎn)生,格列本脲及氟西汀均可抑制該過程。（二）抑郁模型小鼠共病糖代謝紊亂1、CUMS誘導(dǎo)的抑郁模型小鼠呈現(xiàn)胰島素分泌和耐量異常,空腹血胰島素濃度升高,格列本脲可減輕胰島素耐量受損。2、CUMS誘導(dǎo)的抑郁模型小鼠海馬區(qū)胰島素信號(hào)通路異常,AKT1磷酸化（Ser473）水平受抑制,格列本脲對(duì)此具有改善作用。3、CUMS可以降低胰島組織中胰島B細(xì)胞占比,格列本脲與氟西汀均對(duì)其有保護(hù)作用。4、CUMS促進(jìn)F4/80陽(yáng)性巨噬細(xì)胞在胰島組織異常聚積,格列本脲可以明顯改善。5、與中樞神經(jīng)系統(tǒng)類似,CUMS可能通過上調(diào)TXNIP,誘發(fā)胰腺組織NLRP3炎性小體活化及IL-1β產(chǎn)生,格列本脲及氟西汀干預(yù)對(duì)其均有抑制作用。（三）高糖環(huán)境激活小鼠NLRP3炎性小體1、體外高濃度葡萄糖環(huán)境（50mM）能夠激活小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）NLRP3炎性小體,促進(jìn)IL-1β的合成與分泌,此過程不依賴于滲透壓的升高。2、體外高糖環(huán)境不依賴于經(jīng)典的TLR4/MyD88信號(hào)通路,誘發(fā)炎性小體激活第一信號(hào)關(guān)鍵分子NF-κBp65亞基磷酸化。3、NF-κB特異性抑制劑能有效阻斷高糖誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活及IL-1β產(chǎn)生。4、體外高糖環(huán)境可以促進(jìn)炎性小體激活第二信號(hào)關(guān)鍵分子ROS生成及PKR磷酸化,上調(diào)P₂X₇R及TXNIP的表達(dá)。5、PKR或P₂X₇R特異性抑制劑均可阻斷高糖誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活及IL-1β產(chǎn)生。6、ROS清除劑可以有效抑制PKR磷酸化及TXNIP表達(dá),并阻斷高糖誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活及IL-1β產(chǎn)生,但不能改變P₂X₇R的表達(dá)。7、新型特異性抑制劑MCC950可以高效阻斷高糖誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活及IL-1β產(chǎn)生。（四）糖尿病模型小鼠共病抑郁樣行為1、單次腹腔注射STZ通過損傷胰島B細(xì)胞構(gòu)建小鼠糖尿病（高血糖）模型,炎性小體抑制劑MCC950對(duì)血糖影響不顯著。2、STZ誘導(dǎo)的高血糖模型小鼠呈現(xiàn)抑郁樣行為,MCC950可有效緩解。3、STZ誘導(dǎo)的高血糖模型小鼠血清IL-1β濃度升高,MCC950可顯著改善。4、STZ誘導(dǎo)的高血糖模型小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活,MCC950具有抑制作用;星形膠質(zhì)細(xì)胞未見明顯異常。5、STZ誘導(dǎo)的高血糖模型小鼠海馬區(qū)NLRP3炎性小體激活,IL-1β表達(dá)增加,MCC950具有高效抑制作用。結(jié)論:綜上所述,慢性應(yīng)激可以系統(tǒng)性激活NLRP3炎性小體,進(jìn)而誘發(fā)小鼠抑郁樣行為共病糖代謝紊亂;高濃度葡萄糖環(huán)境能夠激活小膠質(zhì)細(xì)胞中的NLRP3炎性