減數(shù)分裂同源重組相關(guān)基因與犏牛雄性不育關(guān)系的研究

減數(shù)分裂同源重組相關(guān)基因與犏牛雄性不育關(guān)系的研究黃牛和牦牛雜交F1代犏牛雄性不育是牦牛雜交改良和雜種優(yōu)勢(shì)利用的最大障礙,因此探明F1代犏牛雄性不育的機(jī)理成為牦牛雜交育種與改良亟待解決的重要問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)犏牛雄性不育可能與精母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中DNA分子的損傷尤其是DNA雙鏈斷裂(doublestrandbreak,DSB)有關(guān)。Dmcl(disruptedmeioticcDNA).Rad51(recombinationproteinA)、RPAl(replicationproteinA,RPA)和BLM(Bloomsyndromeprotein)基因是參與哺乳動(dòng)物減數(shù)分裂同源重組修復(fù)的關(guān)鍵基因,這些基因的突變、敲除和表達(dá)水平的降低均會(huì)引起精母細(xì)胞減數(shù)分裂障礙,最終導(dǎo)致雄性不育。為探討減數(shù)分裂期同源重組相關(guān)基因與犏牛雄性不育的關(guān)系,本文采用RT-PCR克隆測(cè)序、熒光定量PCR和生物信息學(xué)的方法對(duì)Dmcl、Rad5l、RPAl和BLM基因進(jìn)行了分析,結(jié)果如下：1.黃牛、牦牛和犏牛Dmcl基因的克隆、序列分析及表達(dá)的研究根據(jù)黃牛Dmcl基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出牦牛和犏牛睪丸組織Dmcl基因部分cDNA序列,全長(zhǎng)均為1059bp,兩段序列包含完整的ORF,全長(zhǎng)為1023bp,編碼340個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),犏牛氨基酸序列與黃牛和牦牛的同源性為100%,與其他動(dòng)物也具有較高的同源性；牛Dmcl與其它物種一樣,含有大腸桿菌(E.coli)RecA蛋白家族保守的第二結(jié)構(gòu)域部分,包括兩個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和DNA結(jié)合區(qū),說(shuō)明Dmcl蛋白在功能和進(jìn)化上是高度保守的,推測(cè)牛Dmcl與人、鼠一樣,在精母細(xì)胞減數(shù)分裂同源重組過(guò)程發(fā)揮重要作用。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),黃牛、牦牛和犏牛首先聚為一類,然后再與其他哺乳動(dòng)物聚類,與鳥綱動(dòng)物距離較遠(yuǎn),與經(jīng)典分類學(xué)方法一致。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示,Dmcl基因在犏牛睪丸組織中的表達(dá)水平極顯著低于黃牛和牦牛睪丸組織的表達(dá)水平(P<0.01),且犏牛表現(xiàn)出來(lái)的減數(shù)分裂障礙表型與小鼠Dmcl基因突變或敲除的表型一致,推測(cè)Dmcl基因可能與犏牛的雄性不育可能有一定的關(guān)系,是犏牛雄性不育的候選基因。2.黃牛、牦牛和犏牛睪丸組織中Rad51基因mRNA表達(dá)水平研究根據(jù)黃牛Rad51基因序列設(shè)計(jì)引物,并以黃牛、牦牛和犏牛睪丸組織RNA為模板,通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)犏牛及其親本睪丸組織中Rad51基因的表達(dá)水平,結(jié)果表明：Rad51基因在黃牛睪丸組織中的表達(dá)量最高,犏牛次之,牦牛最低,但差異均不顯著,說(shuō)明Rad5l基因的mRNA表達(dá)水平可能與犏牛的雄性不育無(wú)關(guān),而牦牛和犏牛睪丸組織Rad5l基因的低表達(dá)可能與其所生活的環(huán)境也有一定的關(guān)系。3.黃牛、牦牛和犏牛睪丸組織中RPAl基因mRNA表達(dá)水平研究根據(jù)黃牛RPAl基因序列設(shè)計(jì)引物,并以黃牛、牦牛和犏牛睪丸組織RNA為模板,通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)犏牛及其親本睪丸組織中RPAl基因的表達(dá)水平,結(jié)果表明：RPAl基因在犏牛睪丸組織中的表達(dá)水平顯著高于其在黃牛、牦牛睪丸組織中的表達(dá)水平,差異顯著(P<0.05),說(shuō)明RPAl基因mRNA表達(dá)水平與犏牛雄性不育可能有一定關(guān)系。4.黃牛、牦牛和犏牛睪丸組織中BLM基因nRNA表達(dá)水平研究根據(jù)黃牛BLM基因序列設(shè)計(jì)引物,并以黃牛、牦牛和犏牛睪丸組織RNA為模板,通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)犏牛及其親本睪丸組織中BLM基因的表達(dá)水平,結(jié)果表明：BLM基因在黃牛、牦牛和犏牛睪丸組織中都有表達(dá),但差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明BLM基因的mRNA表達(dá)水平可能與