腐霉屬的DNA條形碼和分子系統(tǒng)學(xué)研究

腐霉屬的DNA條形碼和分子系統(tǒng)學(xué)研究腐霉(Pythium)是世界性分布的一類菌物,大多數(shù)物種腐生于土壤、水和動(dòng)植物殘?bào)w中,有些物種是動(dòng)植物的重要病原菌。中國(guó)幅員遼闊,多樣的生態(tài)環(huán)境蘊(yùn)藏著豐富的腐霉資源。本文以從我國(guó)不同植物根際土壤中分離的腐霉菌株和從中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)收集到的腐霉菌株為材料,開(kāi)展了腐霉屬的分類學(xué)、DNA條形碼及分子系統(tǒng)學(xué)研究,并應(yīng)用篩選到的DNA條形碼對(duì)廣西草坪腐霉的群落組成與物種多樣性進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查。主要取得如下結(jié)果：1、根據(jù)形態(tài)特征與COI(細(xì)胞色素C氧化酶第1亞基基因)和ITS序列分析,將分離和收集的525株腐霉菌鑒定為51個(gè)分類單元,其中包括已發(fā)表的5個(gè)新種：田野腐霉(Pythiumagreste)、百色腐霉(P.baisense)、短枝腐霉(P.breve)、廣西腐霉(P.guangxiense)和武漢腐霉(P.wuhanense),12個(gè)中國(guó)新記錄種：引雄腐霉(P.attrantheridium)、鐘形腐霉(P.campanulatum)、囊形腐霉(P.folliculosum)、長(zhǎng)囊腐霉(P.longisporangium)、卵突腐霉(P.oopapillum)、滿器腐霉(P.pleroticum)、多卵腐霉(P.plurisporium)、固執(zhí)腐霉(P.recalcitrans)、稻根腐霉(P.rhizo-oryzae)、高山腐霉(P.takayamanum)、土棲腐霉(P.terrestris)和姜腐霉(P.zingiberis),還有10個(gè)待發(fā)表的疑似新種。2、從4個(gè)DNA片段即COI、COII(細(xì)胞色素C氧化酶第2亞基基因)、ITS和β-tub(Beta-微管蛋白基因)中篩選腐霉的條形碼。綜合PCR和測(cè)序成功率兩項(xiàng)指標(biāo),獲得DNA片段的容易程度從高到低的排序?yàn)镃OII(100%)>COI(97.1%)>ITS(83.1%)>β-tub(68.7%).COI(平均種內(nèi)相似率,簡(jiǎn)稱AS=0.993)的種內(nèi)相似水平接近COII(AS=0.994)和ITS(AS=0.993).但低于β-tub(AS=0.996),而COI(平均種間相似率,簡(jiǎn)稱ASi=0.921)的種間相似水平接近CoII(ASi=0.912)、但高于ITS(ASi=0.627)和β-tub(ASi=0.881)。COI和COII序列的種內(nèi)和種間相似率之間有一條相對(duì)清晰的分界線,而ITS和β-tub序列的種內(nèi)和種間相似率之間重疊嚴(yán)重。對(duì)于本研究的51個(gè)腐霉分類單元,4個(gè)備選DNA片段都不能區(qū)分的為P.folliculosum與簇囊腐霉(P.torulosum)以及P.guangxiense與周雄腐霉(P.periilum),COI和β-tub不能區(qū)分的為群結(jié)腐霉(P.myriotylum)與P.zingiberis,COII和ITS不能區(qū)分的為異絲腐霉(P.diclinum)與寬雄腐霉(P.dissotocum),ITS和β-tub不能區(qū)分的為寡雄腐霉(P.oligandrum)與疑似新種Pythiumsp.nov.4,ITS不能區(qū)分開(kāi)的為P.folliculosum、P.torulosum與P.rhizo-oryzae以及刺腐霉(P.spinosum)與疑似新種Pythiumsp.nov.7,B-tub不能區(qū)分開(kāi)的為P.spinosum與疑似新種Pythiumsp.nov.6以及林棲腐霉(P.sylvaticum)、疑似新種Pythiumsp.nov.9與P.terrestris,因此,COI、COII、ITS和β-tub等4個(gè)DNA片段對(duì)腐霉物種識(shí)別率從高到低的順序?yàn)镃OI(88.2%)=COII(88.2%)>ITS(78.4%)>β-tub(74.5%)。初步研究結(jié)果表明,COI和COII對(duì)腐霉屬的識(shí)別效果比ITS和β-tub更好,由于目前公用分子數(shù)據(jù)庫(kù)中腐霉屬COII序列數(shù)據(jù)所涉及到的物種還非常有限,COI序列數(shù)據(jù)相對(duì)豐富,因此,建議把COI作為腐霉的主要條形碼,COII作為腐霉的輔助條形碼。3、單基因和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,ITS、ITS與COI聯(lián)合以及COI、COII、ITS和β-tub四片段聯(lián)合都能反映出腐霉屬的系統(tǒng)演化關(guān)系。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn),四基因結(jié)合系統(tǒng)樹(shù)上的主要進(jìn)化分枝與形態(tài)特征的對(duì)應(yīng)關(guān)系最好,該系統(tǒng)樹(shù)根據(jù)進(jìn)化分枝的演化關(guān)系將腐霉的孢子囊清晰地劃分為三種類型：絲狀或絲狀與球形結(jié)構(gòu)組成的復(fù)合體孢子囊類型、串生球形或腫囊狀與球形結(jié)構(gòu)組成的復(fù)合體孢子囊類型以及單生球形孢子囊類型。其中串生球形或腫囊狀與球形結(jié)構(gòu)組成的復(fù)合體孢子囊類型處于絲狀或絲狀與球形結(jié)構(gòu)組成的復(fù)合體孢子囊類型和單生球形孢子囊類型之間,這種類型是兩者之間的過(guò)渡階段。傳統(tǒng)上,在分類檢索表中作為區(qū)別腐霉屬物種的有性繁殖體的形態(tài)特征與各分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的大進(jìn)化枝沒(méi)有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。4、以COI作為主要條形碼對(duì)從廣西草坪土壤中分離到的122個(gè)腐霉菌株進(jìn)行分子鑒定得到24個(gè)分類單元。廣西草坪腐霉的群落組成與多樣性分析結(jié)果表明,季節(jié)對(duì)腐霉的物種豐度(F=8.945,P=0.000)和Shannon’s多樣性指數(shù)(F=4.599,P=0.004)有極顯著影響,其中物種豐度在冬季(1.10±0.18)顯著高于夏季(0.43±0.12)和秋季(0.20±0.10),春季(0.80±0.15)顯著高于秋季(0.20±0.10)；Shannon’s多樣性指數(shù)在冬季(0.26±0.07)顯著高于秋季(0.04±0.03)和夏季(0.03±0.03)。同樣地理位置對(duì)腐霉的物種豐度(F=3.087,P=0.013)也有顯著影響,其中桂林的物種豐度(1.00±0.22)顯著高于北海(0.15±0.0