天然小分子化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出泡性死亡的篩選與機(jī)制研究

天然小分子化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出泡性死亡的篩選與機(jī)制研究大多數(shù)化療藥物通過凋亡依賴的方式發(fā)揮其抗腫瘤活性。然而,除了藥物的毒副作用外,復(fù)發(fā)性腫瘤患者產(chǎn)生的化療藥物耐受、多藥耐藥現(xiàn)象普遍,嚴(yán)重制約藥物的治療效果。盡管藥物耐受的機(jī)制有很多深入細(xì)致的研究,但因其機(jī)制復(fù)雜,各種信號通路、蛋白因子交互參與,其逆轉(zhuǎn)藥物的研究一直倍受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞為維持自身的快速增殖,某些信號、蛋白合成與降解途徑等存在缺陷,也是耐藥的機(jī)制之一,如腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制存在異常,誘導(dǎo)凋亡蛋白突變、缺失等對凋亡誘導(dǎo)劑不敏感,產(chǎn)生化療耐受。因此,通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞以凋亡非依賴的方式死亡可能為凋亡抵抗相關(guān)的多藥耐藥惡性腫瘤的治療提供一種有效的策略和思路,相關(guān)的誘導(dǎo)劑研究日益增多,并證實激活非凋亡式細(xì)胞死亡或同時存在的凋亡積累可增加腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性。凋亡非依賴性細(xì)胞死亡的機(jī)制已有多種,如旁凋亡、自噬性細(xì)胞死亡、壞死性細(xì)胞凋亡、巨泡性細(xì)胞死亡等。其中旁凋亡、自噬性細(xì)胞死亡多有出泡現(xiàn)象伴隨,稱之為出泡性細(xì)胞死亡。旁凋亡是非凋亡性細(xì)胞死亡的形式之一,其特點為caspase非依賴并缺乏凋亡性細(xì)胞死亡的形態(tài),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)腫脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和／或線粒體產(chǎn)生大量空泡。雖然引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和／或線粒體擴(kuò)張的相關(guān)機(jī)制尚不明確,但是有研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的從頭合成與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在旁凋亡過程中扮演重要角色,因為抑制蛋白的合成可以減弱空泡化現(xiàn)象。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可通過引起未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinresponse,UPR)導(dǎo)致細(xì)胞死亡,其主要通過三條內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳感通路：雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(1proteinkinaseRNAlikeERkinase,PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activatingtranscriptionfactor-6,ATF6)及肌醇需求酶1(inositolrequiringprotein-1,IRE1)。自噬性細(xì)胞死亡發(fā)生時,細(xì)胞胞漿產(chǎn)生大量游離的膜狀結(jié)構(gòu)使細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)“泡”狀結(jié)構(gòu),隨之形成雙層膜結(jié)構(gòu)的空泡,其內(nèi)部主要為“廢棄”細(xì)胞器甚至含有部分細(xì)胞漿,稱為自噬泡(Autophagosome)。就目前的研究進(jìn)展,自噬泡起源尚不清楚,有人認(rèn)為來自于細(xì)胞內(nèi)膜性細(xì)胞器,如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體及其膜囊泡體等,也有人認(rèn)為這些膜狀結(jié)構(gòu)是重新合成的。在哺乳動物中,自噬泡的起始過程主要由Atg蛋白家族成員介導(dǎo),在自噬形成過程中伴隨LC3(Microtubule-associatedprotein1lightchain3,MAP1-LC3)的參與。結(jié)果：第一部分天然化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的活性篩選1.苯并喹諾里西啶類化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞空泡樣死亡本論文首先利用人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231,MCF-7),人宮頸癌細(xì)胞(Hela),人慢性髓原白血病細(xì)胞(K562),人前列腺癌細(xì)胞(PC3,DU145)和人正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE1)為篩選模型,對35種苯并喹諾里西啶類化合物進(jìn)行了活性篩選。發(fā)現(xiàn)苯并喹諾里西啶類化合物具有良好的抗腫瘤活性,對其中活性較高的化合物進(jìn)行復(fù)篩,觀察其誘導(dǎo)細(xì)胞胞漿產(chǎn)生的空泡化現(xiàn)象。2.雙聯(lián)芐類衍生物協(xié)同蛋白酶體抑制劑MG132誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞空泡樣死亡前期研究發(fā)現(xiàn),雙聯(lián)芐類化合物中,地錢素C(MarchantinC,MC)在體內(nèi)外具有一定抗腫瘤活性,同時可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞旁凋亡性細(xì)胞死亡。本論文中,我們進(jìn)一步將地錢素C與MG132聯(lián)用,發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞胞漿空泡和死亡方面二者具有協(xié)同作用。第二部分化合物22b誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞旁凋亡的機(jī)制研究前期對新型苯并喹諾里西啶類衍生物的抗腫瘤活性篩選結(jié)果表明,此類生物堿作為抗腫瘤化合物,具有同時誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和旁凋亡兩種死亡途徑的特征,對于化療抵抗的抗腫瘤治療有一定優(yōu)勢,存在巨大的研究潛力,從中選出化合物22b為代表化合物,前列腺癌(Prostatecancer,PCa)細(xì)胞為模型進(jìn)行凋亡非依賴性死亡的機(jī)制研究。1.化合物22b引起腫瘤細(xì)胞周期阻滯、凋亡和空泡化現(xiàn)象我們利用流式細(xì)胞技術(shù)分析了化合物22b對PCa的細(xì)胞周期及凋亡的影響,結(jié)果顯示,化合物22b可將細(xì)胞阻滯于G0/G1期,同時引起濃度依賴的一定程度的細(xì)胞凋亡。但是泛硫胱胺酸蛋白酶抑制劑(Z-VAD-fmk)未能完全逆轉(zhuǎn)化合物22b引起的胞漿內(nèi)空泡和細(xì)胞死亡,所以空泡的形成在caspase依賴細(xì)胞死亡中扮演重要角色。2.化合物22b介導(dǎo)的旁凋亡依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白合成(1)化合物22b誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：westernblotting結(jié)果顯示,化合物22b可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白GRP78的表達(dá)以時間依賴的方式上調(diào),PERK與XBP1通路在早期被激活,表明化合物22b確實在早期可誘導(dǎo)由蛋白合成增加引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。CHOP在晚期被激活,啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生的凋亡通路。(2)化合物22b依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白合成介導(dǎo)旁凋亡：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑4-PBA可以顯著逆轉(zhuǎn)化合物22b引起的空泡樣細(xì)胞死亡,此外,抑制蛋白翻譯的放線菌酮(CHX)和抑制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄的放線菌素D(Act-D)同樣具有一定逆轉(zhuǎn)作用,說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白合成在化合物22b引起的空泡樣細(xì)胞死亡中扮演重要角色。(3)蛋白酶體抑制劑與化合物22b具有協(xié)同作用：經(jīng)典蛋白酶體抑制劑MG132和硼替佐米具有誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用,二者分別顯著增加化合物22b引起的細(xì)胞死亡,進(jìn)一步驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在化合物22b誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的具有重要作用。3.化合物22b通過LC3的非自噬作用引起細(xì)胞空泡化(1)自噬在化合物22b引起的細(xì)胞毒中的作用：我們將pH敏感的LC3雙熒光報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞,加藥處理后發(fā)現(xiàn)自噬體并未與溶酶體融合,同時脂質(zhì)型LC3BII曾加且聚集在空泡的邊緣,自噬底物p62積累。自噬的抑制劑3-MA和E-64d可在很少程度上逆轉(zhuǎn)空泡樣細(xì)胞死亡。(2)LC3的非自噬作用：利用RNA干擾技術(shù)降低LC3B的表達(dá)水平后可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)胞漿空泡的形成,以上結(jié)果提示我們,化合物22b誘導(dǎo)的胞漿內(nèi)空泡與LC3BII存在時,非自噬的空泡形成作用相關(guān)。4.化合物22b的抗腫瘤活性在體內(nèi)的驗證通過裸鼠荷瘤實驗發(fā)現(xiàn)化合物22b在體內(nèi)同樣具有良好抑制腫瘤生長作用,同時相較于同等劑量的陽性藥物多西紫杉醇具有較低細(xì)胞毒性。第三部分地錢素C與MG132聯(lián)用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞旁凋亡的機(jī)制研究1.地錢素C與蛋白酶體抑制劑的聯(lián)用效應(yīng)在體內(nèi)的驗證在裸鼠荷瘤實驗中,根據(jù)腫瘤體積及重量等數(shù)據(jù)顯示,地錢素C與蛋白酶體抑制劑存協(xié)同作用,且聯(lián)用組與高劑量硼替佐米組相比,具有相當(dāng)?shù)囊至鲂Ч?同時不產(chǎn)生明顯肝毒性。說明二者的聯(lián)用可為臨床用藥提出指導(dǎo)性意義。2.PLIN2可能參與地錢素C與MG132聯(lián)用誘導(dǎo)的細(xì)胞空泡化(1)根據(jù)基因差異表達(dá)譜芯片結(jié)果,我們篩選出協(xié)同上調(diào)5倍以上的差異基因,并進(jìn)一步選擇PLIN2研究在地錢素C與MG132聯(lián)用誘導(dǎo)的細(xì)胞空泡化中的作用。(2)利用RNA干擾技術(shù)降低PLIN2基因表達(dá)后,地錢素C與MG132聯(lián)用引起的空泡被顯著消除,說明PLIN2可能與胞漿內(nèi)空泡現(xiàn)象相關(guān)。結(jié)論：1.通過對多種天然化合物進(jìn)行活性及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞胞漿空泡現(xiàn)象的篩選,確定22b和地錢素C為潛力化合物,針對二者誘導(dǎo)的旁凋亡進(jìn)行深入地機(jī)制研究。2.化合物22b可以引起腫瘤細(xì)胞周期阻滯、凋亡和空泡化現(xiàn)象。3.化合物22b誘導(dǎo)以空泡化現(xiàn)象為特征的旁凋亡依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,蛋白合成以及LC3的非自噬作用。4.動物實驗的結(jié)果表明,地錢素C與蛋白酶體抑制劑存在協(xié)同作用,二者聯(lián)用可以增加抑瘤效果同時減少藥物的毒性。5.根據(jù)基因差異表達(dá)譜芯片結(jié)果篩選,PLIN2可能參與地錢素C與MG132聯(lián)用誘導(dǎo)的細(xì)胞空泡化。創(chuàng)新點與不足之處：1.創(chuàng)新點1.1首次報道以苯并喹諾里西啶類化合物為模型研究腫瘤細(xì)胞旁凋亡的機(jī)制,且通過實驗驗證,化合物22b引起的空泡化和細(xì)胞死亡依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,蛋白合成以及LC3的非自噬作用。1.2首次報道地錢素C與蛋白酶體抑制劑具有協(xié)同作用,并在動物體內(nèi)進(jìn)行驗證；首次報道根據(jù)基因差異表達(dá)譜芯片結(jié)果篩選出的PLIN2可能參與地錢素C與MG132聯(lián)用誘導(dǎo)的細(xì)胞空泡化。2.不足2.1LC3在非凋亡依賴的細(xì)胞死亡中通過自噬途徑和非自噬性作用這兩方面扮演重要角色,有文獻(xiàn)報道ATF4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生后顯著上調(diào),通過其轉(zhuǎn)錄因子的作用可對LC3的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié),但是否存在其他調(diào)控機(jī)制仍需深入研究。下一步工作將通過尋找與LC3相互結(jié)合蛋白確定其與空泡形成之間的關(guān)系。2.2前期結(jié)果表明,地錢素C可以抑制蛋白酶體