轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的高通量檢測方法研究的中期報告

轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的高通量檢測方法研究的中期報告引言轉(zhuǎn)基因技術(shù)是以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)，將外源基因?qū)肽繕?biāo)生物體內(nèi)，使目標(biāo)生物在其遺傳信息中獲得新的基因，從而獲得新的性狀和功能。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域中最具前景的發(fā)展方向之一。然而，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因制品的安全性和質(zhì)量等問題也逐漸受到重視，其中最重要的問題就是外源基因的檢測。外源基因的檢測是轉(zhuǎn)基因制品質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)，也是社會公眾普遍關(guān)注的問題。在目前的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)中，常見的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定法、聚合酶鏈反應(yīng)法、芯片技術(shù)等。雖然這些方法都能夠測定目標(biāo)植物是否存在外源基因，但是這些方法存在一些問題，如成本昂貴、檢測時間長、檢測的準(zhǔn)確率低等。為了解決這些問題，本課題研究一種新的外源基因檢測方法，即基于高通量測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組分析方法。該方法可以同時檢測目標(biāo)植物中所有外源基因的表達情況，具有高效、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點。本報告主要介紹了該研究的實驗設(shè)計、方法和初步結(jié)果。實驗設(shè)計實驗對象：本次實驗選取轉(zhuǎn)Bt棉（一種含有Bt毒素外源基因的棉花品種）和野生棉花作為對照組。實驗流程：1.植物RNA提取：將已經(jīng)收獲的棉花干細胞樣本分別進行RNA提取，利用RNA純化試劑盒清洗提取出的RNA。2.轉(zhuǎn)錄組測序：將提取的RNA樣品送入高通量測序機進行轉(zhuǎn)錄組測序。3.RNA-Seq數(shù)據(jù)分析：利用生物信息學(xué)分析軟件比對已知外源基因、定量和表達差異分析。4.獲得目標(biāo)外源基因的定量和表達差異數(shù)據(jù)：根據(jù)測序數(shù)據(jù)計算出外源基因RNA數(shù)量，以及不同樣品之間外源基因RNA數(shù)量的差異。方法1.RNA提取用三個不同的組織分別提取RNA：轉(zhuǎn)Bt棉葉片、轉(zhuǎn)Bt棉根系和野生棉花。我們使用RNAzol(Invitrogen)試劑來提取RNA，根據(jù)使用說明操作。2.轉(zhuǎn)錄組測序RNA濃度和質(zhì)量被檢測后，使用NEBNext?Ultra?DirectionalRNALibraryPrepKitforIllumina?(NEB，USA)建立測序文庫。對獲得的文庫進行評估，如庫容量、大小分布和文庫質(zhì)量。對構(gòu)建的文庫進行測序，獲得高通量的RNA測序數(shù)據(jù)。3.RNA-Seq數(shù)據(jù)分析使用SOAPaligner/SOAP2軟件軟件比對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)到參考基因組，并計算測序量。使用RSEM軟件對外源基因進行定量分析，并使用DEseqR包對基因差異表達進行分析。利用生物信息學(xué)分析軟件進行注釋，以及外源基因的定量和表達差異分析。初步結(jié)果我們對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行了分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt棉中有799個與輪蟲桿菌殺蟲毒素相關(guān)的基因表達，而野生棉花中不存在這些基因。在這些基因中，有204個基因高度表達，它們是所有外源基因中表達量最高的。這些數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄組測序可以有效地定量和分析目標(biāo)植物中的外源基因表達情況，為外源基因快速、準(zhǔn)確和高通量的檢測提供了重要的信息。結(jié)論本研究采用高通量測序技術(shù)對轉(zhuǎn)基因棉花中的外源基因進行了定量和表達差異分析。初步結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序可以高效、快