薄層色譜鑒別介紹

關(guān)于薄層色譜鑒別介紹概念薄層色譜法(TLC)將固定相(如硅膠)薄薄地均勻涂敷在底板(或棒)上，試樣點在薄層一端，在展開罐內(nèi)展開，由于各組分在薄層上的移動距離不同，形成互相分離的斑點，測定各斑點的位置及其密度就可以完成對試樣的定性、定量分析的色譜法。第2頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法，它利用各成分對同一吸附劑吸附能力不同，使在移動相（溶劑）流過固定相（吸附劑）的過程中，連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達到各成分的互相分離的目的。

基本原理第3頁,共56頁，2024年2月25日，星期天在給定的條件下（吸附劑、展開劑、板層厚度等），化合物移動的距離和展開劑移動的距離之比是一定的，即Rf值是化合物的物理常數(shù)，其大小只與化合物本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此可以根據(jù)Rf值鑒別化合物。第4頁,共56頁，2024年2月25日，星期天比移值組分二組分一被分離混合物薄層色譜展開示意圖第5頁,共56頁，2024年2月25日，星期天薄層色譜法優(yōu)點

操作簡單，定性結(jié)果直觀缺點有一定毒性、定量方面的精密度較差第6頁,共56頁，2024年2月25日，星期天實驗儀器⑴載板⑵固定相（吸附劑）或載體⑶涂布器⑷點樣器⑸展開室

實驗操作第7頁,共56頁，2024年2月25日，星期天實驗操作1薄層板的制備

吸附劑（硅膠）調(diào)制玻璃板涂布調(diào)制時慢慢攪拌，勿使產(chǎn)生氣泡。均勻涂布在玻璃板上，搖動攤平，晾干。使用前放入烘箱內(nèi)，在105-115℃左右烘干40-50min。冷卻后使用。粘合劑、添加劑第8頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

固定相（吸附劑）的選擇纖維素、淀粉硅酸鎂硫酸鈣

硅膠佛羅里硅土氧化鎂

氧化鋁活性炭對極性有機物的吸附作用增強第9頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2

供試品的制備：按照各藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進行提取分離。制得的供試品應(yīng)放置于密塞的小瓶中，防止溶劑揮發(fā)影響點樣量。

3對照品溶液的制備：可按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定精配成一定濃度的對照品溶液，置密塞小瓶中備用。標(biāo)準(zhǔn)藥材對照溶液，一般需照供試品的制備方法制備。在使用對照品溶液時一定要注意將取樣的毛細管充分洗干凈，防止造成對照品污染。第10頁,共56頁，2024年2月25日，星期天4

點樣：按規(guī)定吸取溶液用定量點樣毛細管或色譜用微量注射器點樣于薄層板上。點樣基線距底邊的距離為1～2cm，點間距一般為1.0-1.5cm。點樣直徑一般應(yīng)小于5mm。兩個以上的點樣應(yīng)在同一水平線上，并與薄層板的底邊平行。點樣時必須注意勿損傷薄層表面。第11頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

點樣示意圖對照品樣供試品樣點樣直徑≤5mm1cm≤點間距≤1.5cm1-2cm第12頁,共56頁，2024年2月25日，星期天自動點樣器毛細管點樣第13頁,共56頁，2024年2月25日，星期天5展開展開室展開劑（流動相）的選擇：主要根據(jù)樣品中各組分的極性、溶劑對于樣品中各組分溶解度等因素來考慮。第14頁,共56頁，2024年2月25日，星期天展開劑的選擇

正己烷環(huán)己烷四氯化碳甲苯氯仿正丁醇乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水溶劑的洗脫能力隨溶劑的極性增大而增強在一塊薄層板上進行試驗：若所選展開劑使混合物中所有的組分點都移到了溶劑前沿，此溶劑的極性過強；若所選展開劑幾乎不能使混合物中的組分點移動，留在了原點上，此溶劑的極性過弱。理想的展開劑應(yīng)能使混合物分離后各組分的Rf值相差盡可能大。各組分理想的比移值在0.2-0.8之間。當(dāng)一種溶劑不能很好地展開各組分時，常選擇用混合溶劑作為展開劑。先用一種極性較小的溶劑為基礎(chǔ)溶劑展開混合物，若展開不好，用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調(diào)整極性，再次試驗，直到選出合適的展開劑組合。

第15頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1-2cm展開示意圖展開劑要接觸到薄層板下沿，但切勿接觸到樣點。蓋上蓋子，展開。觀察展開情況。取出薄層板第16頁,共56頁，2024年2月25日，星期天上升法傾斜上行法下降法展開方式示意圖第17頁,共56頁，2024年2月25日，星期天影響展開的因素A相對濕度的影響

B溶劑系統(tǒng)的影響C溶劑蒸汽的影響D薄層板類型的影響E溫度的影響F展距的影響第18頁,共56頁，2024年2月25日，星期天A相對濕度的影響 吸附劑的活度隨相對濕度的增大而降低。20cm×20cm的硅膠薄層板在50%的相對濕度中： 放置3分鐘失去活性一半 放置15分鐘吸附水分達最大值 薄層在相對濕度為1-80%的情況下展開，Rf值可以相差3倍。 最佳相對濕度范圍決定于溶質(zhì)和溶劑的極性，極性越大，相對濕度范圍也相應(yīng)增大。

第19頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共56頁，2024年2月25日，星期天B溶劑系統(tǒng)的影響溶劑系統(tǒng)不同，組分的分配系數(shù)不同，故Rf值不同。在平面電泳中，溶液的離子強度增大，組分的泳動速度減小。第21頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共56頁，2024年2月25日，星期天預(yù)飽和分為2部分：

1、展開缸的預(yù)飽和：在展開之前，使展開劑蒸汽在展開缸內(nèi)飽和，使展開缸汽液狀態(tài)達到一定的穩(wěn)定狀態(tài)，此時尚未放薄層板。

2、薄層板的預(yù)飽和：在展開缸飽和后，放入已經(jīng)點樣完畢的薄層板，進行飽和，使薄層板整體差異性減小。具體做法是：在雙槽層析玻璃缸內(nèi),將其中一個槽內(nèi)倒入配好的展開劑,另一個槽內(nèi)放入薄層板,蓋好上面的玻璃蓋,這時候就是在預(yù)飽和。C溶劑蒸汽的影響第24頁,共56頁，2024年2月25日，星期天關(guān)于飽和時間：根據(jù)展開劑而定。

1、展開劑組分極性差異不大的且揮發(fā)性好的，時間可以短一些，一般15－20分鐘即可；

2、極性差異大的，且揮發(fā)性差異大的，時間要長一些，一般要30－60分鐘；

3、極性差異大的，且揮發(fā)性差異不大的，時間要長一些，一般要20－30分鐘；

4、極性差異不大，且揮發(fā)性差不大的，時間可以短一些，一般要10－15分鐘；

5、水飽和有機試劑或有機試劑飽和水的，時間一般都比較長，30－60分鐘。

6、另外，大家打開關(guān)閉展開缸的速度要快，放板取板的速度也要快，否則預(yù)飽和的效果全被你后期的操作給抹殺了??！

第25頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共56頁，2024年2月25日，星期天D1濾紙 紙色譜中所用的濾紙性質(zhì)對分離效果有很大影響。對濾紙的要求是：物理性質(zhì)均勻、質(zhì)地均一、厚薄一致，否則斑點畸形，Rf值改變;2.具有一定的機械強度;3.纖維松緊程度適當(dāng);4.具有一定的純度;5.紙面潔凈，不含有溶于水及有機溶劑的物質(zhì)。D薄層板類型的影響第29頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

色譜用濾紙纖維的方向會影響組分的分離，故每次展開時,濾紙的纖維方向應(yīng)一致.商品濾紙有厚紙、薄紙、慢速、快速、中速等不同類型可供選擇.第30頁,共56頁，2024年2月25日，星期天D2薄層板

有資料表明，60%以上的薄層分離用硅膠作為吸附劑，其次為纖維素、氧化鋁、聚酰胺、硅藻土等。固定相第31頁,共56頁，2024年2月25日，星期天硅膠 硅膠是一種弱酸性的多孔性無定形吸附劑。

硅膠表面有很多硅醇基(－Si－OH)，通過硅原子上的-OH基團與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而表現(xiàn)出吸附性能。硅醇基的數(shù)目越大，則吸附能力增強。 硅膠也能吸附水分而成為水合硅醇基。

第32頁,共56頁，2024年2月25日，星期天氧化鋁 氧化鋁由氫氧化鋁高溫脫水而成。按制備方法不同，氧化鋁可分為三種：堿性氧化鋁：pH=9～10,可分離合成染料，生物堿等酸性氧化鋁：pH=4～5，適應(yīng)于酸性物質(zhì)的分離中性氧化鋁：pH=7～7.5，適于分離醛酮，以及對酸堿不穩(wěn)定的脂和內(nèi)酯等化合物

氧化鋁的活度與其含水量有關(guān)，含水量大，則吸附能力小?；钚约墑eⅠⅡⅢⅣⅤ含水量%-361015第33頁,共56頁，2024年2月25日，星期天纖維素 纖維素分子中帶有許多羥基，親水性強，分離原理與紙色譜相似，但分離效果和分離速度均比紙色譜佳，可以代替紙色譜.第34頁,共56頁，2024年2月25日，星期天普通纖維素：天然纖維素、高純度纖維素、微晶纖維素。乙酰化纖維素：用乙酸將纖維素結(jié)構(gòu)上的羥基酯化而成，適用于反相色譜。離子交換纖維素：纖維素經(jīng)化學(xué)反應(yīng)，使分子中一部分羥基上的氫被陽離子或陰離子交換基取代而成，具有離子交換樹脂的性質(zhì)。纖維素的種類有：第35頁,共56頁，2024年2月25日，星期天聚酰胺聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子聚合物。薄層色譜中常用的聚己內(nèi)酰胺，結(jié)構(gòu)如下：

酰胺中心的酰胺基可與酚類、酸類、硝基類等化合物形成氫鍵而對這些物質(zhì)產(chǎn)生吸附作用。應(yīng)用：蛋白質(zhì)、肽、多糖、核苷酸等的分離。[-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C-N-]nHO第36頁,共56頁，2024年2月25日，星期天葡聚糖

葡聚糖是一種由葡萄糖殘基構(gòu)成的多糖物質(zhì)。葡聚糖凝膠是由一定分子量的葡聚糖懸浮于有機相中，加入交聯(lián)劑交聯(lián)聚合而成。 在葡聚糖分子上引入有機基團，則可成為親脂性凝膠。 在葡聚糖凝膠上引入羧甲基、磺乙基等，則制成具有離子交換性質(zhì)的葡聚糖凝膠離子交換劑。 應(yīng)用：蛋白質(zhì)、肽、多糖、核苷酸等的分離第37頁,共56頁，2024年2月25日，星期天薄層板的種類載板材料：玻璃片、鋁箔、塑料片等薄層板類型：硬板：在固定相中加入粘合劑（煅石膏、淀粉）;軟板：不加粘合劑;燒結(jié)玻璃板：將玻璃粉與硅膠、氧化鋁等吸附劑按一定比例混合后，以丙酮、乙醇或水等溶劑調(diào)成勻漿，涂成薄層，經(jīng)高溫?zé)Y(jié)而成。第38頁,共56頁，2024年2月25日，星期天吸附劑及預(yù)制板包裝上的符號及含義G——加入一定的煅石膏作粘合劑H——不加粘合劑，供制各種軟板用F254——加入對254nm波長能發(fā)熒光的物質(zhì)F254s——加入抗酸性熒光指示劑第39頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共56頁，2024年2月25日，星期天E溫度的影響溫度影響物質(zhì)的分配系數(shù)KD，同時也影響纖維的水合作用，改變固定相的量。第43頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共56頁，2024年2月25日，星期天F展距的影響

第45頁,共56頁，2024年2月25日，星期天薄層色譜法---跑板點樣

用微量進樣器進行點樣。點樣前，先用鉛筆在層析上距末端2cm處輕輕畫一橫線，然后用毛細管吸取樣液在橫線上輕輕點樣，點的斑點較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。如果要重新點樣，一定要等前一次點樣殘余的溶劑揮發(fā)后再點樣（用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干再點），以免點樣斑點過大。一般斑點直徑大于2mm，不宜超過5mm。點好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干。底線距基線1～2．5cm，點間距離為lcm左右，樣點與玻璃邊緣距離至少lcm，為防止邊緣效應(yīng)，第46頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2.展開

將點了樣的薄層板放在盛在有展開劑的展開槽中，由于毛細管作用，展開溶劑在薄層板上緩慢前進，前進至一定距離后，取出薄層板，樣品組分固移動速度不同而彼此分離。展開室應(yīng)預(yù)飽和。為達到飽和效果，可在室中加入足夠量的展開劑，密封室頂?shù)纳w。展開劑一般為兩種以上互溶的有機溶劑，并且臨用時新配為宜。強烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開劑。絕對不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開缸，振搖展開缸來配制展開劑?；旌喜痪鶆蚝蜎]有分液的展開劑，會造成層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準(zhǔn)確度對不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達到實驗室儀器的最高精確度，比如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標(biāo)移液管，薄層板點樣后，應(yīng)待溶劑揮發(fā)完，再放人展開室中展開。展開應(yīng)密閉，展距一般為8～15cm。薄層板放入展開室時，展開劑不能沒過樣點。一般情況下，展開劑浸入薄層下端的高度不宜超過0.5cm。展開劑每次展開后，都需要更換，不能重復(fù)使用。（展開缸中得展開劑棄去，密封在容量瓶中得展開劑可在當(dāng)天使用）展開后的薄層板用適當(dāng)?shù)姆椒?，使溶劑揮發(fā)完全，然后進行檢視。Rf值一般控制在0.3～0.8，當(dāng)Rf值很大或很小時，應(yīng)適當(dāng)改變流動相的比例。第47頁,共56頁，2024年2月25日，星期天3.斑點的檢出展開后的薄層板經(jīng)過干燥后，常用紫外光燈照射或用顯色劑顯色檢出斑點。對于無色組分，在用顯色劑時，顯色劑噴灑要均勻，量要適度。紫外光燈的功率越大，暗室越暗，檢出效果就越好。展開分離后，化合物在薄層板上的位置用比移值(Rf值)來表示?；衔锇唿c中心至原點的距離與溶劑前沿至原點的距離的比值就是該化合物的Rf值。第48頁,共56頁，2024年2月25日，星期天注意事項：一．預(yù)飽和分為2部分：1、展開缸的預(yù)飽和：在展開之前，使展開劑蒸汽在展開缸內(nèi)飽和，使展開缸汽液狀態(tài)達到一定的穩(wěn)定狀態(tài)，此時尚未放薄層板。2、薄層板的預(yù)飽和：在展開缸飽和后，放入已經(jīng)點樣完畢的薄層板，進行飽和，使薄層板整體差異性減小。具體做法是：在雙槽層析玻璃缸內(nèi),將其中一個槽內(nèi)倒入配好的展開劑,另一個槽內(nèi)放入薄層板,蓋好上面的玻璃蓋,這時候就是在預(yù)飽和。關(guān)于飽和時間：根據(jù)展開劑而定。

1、展開劑組分極性差異不大的且揮發(fā)性好的，時間可以短一些，一般15－20分鐘即可；

2、極性差異大的，且揮發(fā)性差異大的，時間要長一些，一般要30－60分鐘；

3、極性差異大的，且揮發(fā)性差異不大的，時間要長一些，一般要20－30分鐘；

4、極性差異不大，且揮發(fā)性差不大的，時間可以短一些，一般要10－15分鐘；

5、水飽和有機試劑或有機試劑飽和水的，時間一般都比較長，30－60分鐘。

6、另外，大家打開關(guān)閉展開缸的速度要快，放板取板的速度也要快，否則預(yù)飽和的效果全被你后期的操作給抹殺了??！第49頁,共56頁，2024年2月25日，星期天二．展開室應(yīng)放在水平、穩(wěn)定的實驗臺上，不能有陽光直射，也不能在通風(fēng)處放置，離開熱源，避免溫度波動對分離不利；光敏物質(zhì)的分離應(yīng)將展開室置于暗處進行。三．點樣時間不應(yīng)超過三分鐘。硅膠的硅醇基以氫鍵形式優(yōu)先吸附水，物理吸附使硅膠的活度降低，影響了弱極性物質(zhì)的吸附，化合物的Rf值相應(yīng)地增大。硅膠薄層的吸水速度很快，當(dāng)用預(yù)先經(jīng)過活化的薄層板，在點樣過程中干燥的薄層會立即吸附空氣中的水蒸氣，在數(shù)分鐘內(nèi)達到平衡，吸附水蒸氣的量決定于點樣速度即暴露在空氣中的時間和空氣的相對濕度。Dallas指出0.25mm厚、20cm×20cm的硅膠薄層板在50%相對濕度中放置約3min就失去活性的一半，而放置15min時吸附的水分已達到最大值。在用相同條件分離同一組化合物得到的結(jié)果不能重現(xiàn)時，必須考慮到相對濕度對展開的影響，特別是我國南北地區(qū)濕度相差很大；即使在同一實驗室冬夏季節(jié)不同濕度也有明顯差別，如果不注意濕度的影響就得不到預(yù)期的結(jié)果。第50頁,共56頁，2024年2月25日，星期天展開時的最佳相對濕度范圍決定于溶質(zhì)和溶劑的極性，隨溶質(zhì)和溶劑極性的增加相對濕度的范圍也相應(yīng)地增大，在用苯作展開劑時，適宜的相對濕度范圍很窄，因此濕度對分離的影響十分明顯；當(dāng)用乙醚為展開劑時，相對濕度在20%-50%,時均