蛋白質(zhì)的測定

關(guān)于蛋白質(zhì)的測定食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測定總氮量，然后乘一個(gè)蛋白質(zhì)換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮，如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測）。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體11%~13%總熱量來自蛋白質(zhì)。無論動(dòng)物、植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量及類型不同。第2頁,共46頁，2024年2月25日，星期天關(guān)于氮-pro換算等數(shù)對于氮含量換算成pro含量的等數(shù)，歷來采用6.25，這個(gè)數(shù)值是以pro平均含氮而導(dǎo)出的數(shù)值，但是食品中含氮的比例，因食品種類不同，差別是很大的，我們在測定pro時(shí)，應(yīng)該是不同的食品采用不同的換算等數(shù)，一般手冊上列出了一部分換稱等數(shù)，用時(shí)可查，蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麥=5.83，玉米=6.25，小麥=5.83，麩皮=6.31，面粉=5.70，如果手冊上查不到的樣品則可用6.25，一般在寫報(bào)告時(shí)要注明采用的換算等數(shù)以何物代替。第3頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)的測定方法分兩大類：

一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)含量；

另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團(tuán)等測定蛋白質(zhì)含量。

具體測定方法：凱氏定氮法——最常用的，國內(nèi)外應(yīng)用普遍。雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑法國外：紅外分析儀第4頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共46頁，2024年2月25日，星期天氨基酸總量——酸堿滴定法測定。各種氨基酸的分離與定量——色譜技術(shù)。有多種氨基酸分析儀。第6頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)蛋白質(zhì)的定性測定一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并變色。書中列舉了5種染料。二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)（一）糖蛋白的顯色（3種方法）（二）脂蛋白的顯色（2種方法）第7頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)蛋白質(zhì)的定量測定

一般說來，動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右，豬肉9.5%，兔肉21%，雞肉20%，牛乳3.5%，帶魚18.0%，大豆40%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黃瓜1.0%，蘋果1.4%

測定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對于評價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意義。第8頁,共46頁，2024年2月25日，星期天一些蛋白質(zhì)的含氮量

一般為15%~17.6%，有的上下浮動(dòng)

可以測出總氮N

一、 凱氏定氮法

由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。書中只介紹前三種。=N×6.25=蛋白質(zhì)含量第9頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

（一）常量凱氏定氮法

1.原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。第10頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

2、整個(gè)過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定

（1）消化總反應(yīng)式：<1>加硫酸鉀作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)，純硫酸沸點(diǎn)340℃，加入硫酸鉀之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%）第11頁,共46頁，2024年2月25日，星期天<2>加硫酸銅作為催化劑。還可以作消化終點(diǎn)指示劑（做蒸餾時(shí)堿性指示劑）。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦。<3>加氧化劑如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度。第12頁,共46頁，2024年2月25日，星期天儀器：要防止爆沸。另外：介紹“自動(dòng)回流消化儀”第13頁,共46頁，2024年2月25日，星期天（2）蒸餾

消化液+40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。

第14頁,共46頁，2024年2月25日，星期天（3）吸收與滴定<1>用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅—溴甲基酚綠混合指示劑）國標(biāo)用亞甲基蘭+甲基紅。指示劑紅色綠色紅色

（酸）（堿）（酸）<2>用過量的H2SO4或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液，用甲基紅指示劑。吸收滴定第15頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3、說明：①所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。②消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。第16頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

③消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪拢⒋龠M(jìn)其消化完全。

④樣品中若含脂肪或糖較多時(shí)，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。⑤當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過氧化氫2—3m1后再繼續(xù)加熱消化。第17頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

⑥若取樣量較大，如干試樣超過5g可按每克試樣5m1的比例增加硫酸用量。

⑦—般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品．如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。⑧蒸餾裝置不能漏氣。第18頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

⑨蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。

氫氧化銅在70～90℃時(shí)發(fā)黑。

⑩蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源．否則可能造成吸收液倒吸。第19頁,共46頁，2024年2月25日，星期天二、 微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點(diǎn)：加入硼酸量有50ml10ml,滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。3、蒸餾裝置見下圖。第20頁,共46頁，2024年2月25日，星期天10-210-2第21頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

三、 自動(dòng)凱氏定氮法

1、原理及適用范圍同前

2、特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。第22頁,共46頁，2024年2月25日，星期天北京福德泰和科技有限公司產(chǎn)品名稱：凱氏定氮儀

第23頁,共46頁，2024年2月25日，星期天二、雙縮脲法傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時(shí)間，有環(huán)境污染。新開發(fā)的：雙縮脲法、紫外分光光度法、染料結(jié)合法、水楊酸比色法等。第24頁,共46頁，2024年2月25日，星期天1. 原理脲（尿素）NH2—CO—NH2

加熱至150~160℃時(shí)，兩分子縮和成雙縮脲。雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)）蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵—CO—NH—與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來測其吸光度，確定含量。（560nm）NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2第25頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

注：測蛋白質(zhì)時(shí)叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化

2. 方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。

3.主要儀器：分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000r/min）

4.試劑：

(1)堿性硫酸銅溶液

(2)四氯化碳第26頁,共46頁，2024年2月25日，星期天5．操作方法：采用凱氏法測出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。三．紫外吸收法

1．原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)，│R（—NH—CH—CO）對紫外光有吸收作用在280nm下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系，求含量。第27頁,共46頁，2024年2月25日，星期天2．適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3．主要儀器：①紫外分光光度計(jì)②離心機(jī)（3000—5000r/min）4．操作：用凱氏法測定作標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線第28頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)氨基酸的定性測定利用各種顯色反應(yīng)第29頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第六節(jié)氨基酸定量測定

一．氨基酸的一般定量測定

（一）甲醛滴定法

1.原理：氨基酸本身有堿性—NH2—基，又有酸性—COOH基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與—NH2—結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定—COOH基。2．特點(diǎn)：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況等。（適于食品中游離氨基酸的測定）第30頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3．雙指示劑：①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至藍(lán)色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液，③0.1%中性紅50%乙醇溶液，④0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4．操作：同時(shí)取兩份樣：①+中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴，中和樣液中其它酸性物質(zhì)。②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴，中和了樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總和。二者之差可計(jì)算氨基酸含量第31頁,共46頁，2024年2月25日，星期天（二）茚三酮的比色法

原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物，可比色定量。顏色深淺與氨基酸含量成正比，最大吸收波長為570nm.（三）電位滴定法第32頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第七節(jié)氨基酸的分離與測定

一．薄層色譜法（薄層層析法（TLC法）ThinLayerChromatography簡介：

近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點(diǎn)在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。因?yàn)閷游鲈诒由线M(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。第33頁,共46頁，2024年2月25日，星期天（一）原理：

取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可以大致確定其含量。

第34頁,共46頁，2024年2月25日，星期天Rf=a/bab樣點(diǎn)溶劑前沿點(diǎn)樣原點(diǎn)第35頁,共46頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)：①展開時(shí)間短，一般在20—30分鐘，展開距離通常只需10cm，且分離效果好。②層析后得到的斑點(diǎn)小而清晰。③能夠使用多種顯色劑。④點(diǎn)樣量少，靈敏度高。（比紙層析高10—100倍）精確到0.01ug。⑤也可用于大量分離＞500mg，作為樣品制備層析。缺點(diǎn)：Rf值重現(xiàn)性比紙上層析差。分類：按層析的原理可分為：吸附、分配、離子交換、凝膠等。第36頁,共46頁，2024年2月25日，星期天（三）操作方法：①薄層板制備②樣品液制備③點(diǎn)樣：距薄板底端2cm處，用針畫一標(biāo)記作為原點(diǎn)。再以點(diǎn)樣距扳子寬窄可點(diǎn)幾個(gè)點(diǎn)同時(shí)展開，點(diǎn)與點(diǎn)之間間隔1～2cm。a.可用毛細(xì)玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等一個(gè)點(diǎn)干了再點(diǎn)另一個(gè)點(diǎn)。b.用一小直徑ф3mm濾紙片，浸入樣液，埋到板子上先挖好一個(gè)小洞穴。第37頁,共46頁，2024年2月25日，星期天④展開：點(diǎn)樣完了，放入密閉容器中（展開槽），傾斜一定角度10～30°，下端浸入展開劑1cm，千萬別讓溶劑浸過了樣點(diǎn)。到離頂端一部分，取出樣板、晾干、顯色。a.展開劑的有關(guān)情況：主要是低沸點(diǎn)的2～3種有機(jī)溶劑組成的溶劑系統(tǒng)，分離效果主要決定于展開劑的選擇，因?yàn)槲絼┰谝欢ㄇ闆r下是恒定的，吸附劑的選擇余地遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于展開劑的選擇。第38頁,共46頁，2024年2月25日，星期天b.展開劑的選擇方法：Ⅰ.微量圓環(huán)法。Ⅱ.用小載波片試驗(yàn)，微量展開劑展開5cm。Ⅲ.圖解法：樣品極性小，選吸附劑活性高，展開劑極性低的。樣品極性大，選吸附劑活性低，展開劑極性高。有機(jī)溶劑極性由小到大為：石油醚、環(huán)己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有機(jī)酸類等。第39頁,共46頁，2024年2月25日，星期天c.展開的方式：上行法、下行法、雙向展開