熒光檢測原理

關(guān)于熒光檢測原理熒光PCR？

熒光標記擴增產(chǎn)物動態(tài)監(jiān)測熒光信號變化第2頁,共49頁，2024年2月25日，星期天熒光染料光能熱能轉(zhuǎn)移給臨近的分子第3頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

熒光標記信號的產(chǎn)生

熒光標記基團在某波長的激發(fā)光刺激下，產(chǎn)生一個更長波長的發(fā)射光第4頁,共49頁，2024年2月25日，星期天熒光信號熒光染料直接結(jié)合擴增產(chǎn)物SYBRgreenI——特異性結(jié)合雙鏈，釋放熒光信號熒光標記引物特異性熒光探針Taqman雙熒光標記探針molecularBeacon熒光標記探針熒光標記雜交雙探針第5頁,共49頁，2024年2月25日，星期天SYBRGREENI第6頁,共49頁，2024年2月25日，星期天FRET？

當某個熒光基團的發(fā)射譜與另一熒光基團的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，這個過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),實際相當于將短波長熒光基團釋放的熒光屏蔽。第7頁,共49頁，2024年2月25日，星期天Taqman？特異性熒光雙標記探針Taq酶5’→3’外切酶活性第8頁,共49頁，2024年2月25日，星期天Molecularbeacon？第9頁,共49頁，2024年2月25日，星期天熒光標記雜交雙探針變性退火延伸第10頁,共49頁，2024年2月25日，星期天CT值—樣本擴增曲線與閾值線交叉點的循環(huán)數(shù)第11頁,共49頁，2024年2月25日，星期天對數(shù)期分析與終點分析的比較第12頁,共49頁，2024年2月25日，星期天熒光PCR重現(xiàn)性第13頁,共49頁，2024年2月25日，星期天標準曲線→定量第14頁,共49頁，2024年2月25日，星期天熒光PCR特點靈敏度高特異性強全封閉PCR過程，無需后處理采用dUTP—UNG酶的防污染系統(tǒng)，有效降低污染機會即時反映擴增過程，摒棄終點數(shù)據(jù)，更適用于定量定量范圍寬，可達到10個數(shù)量級，無須稀釋樣品可實現(xiàn)一管多檢儀器自動分析，更快獲得結(jié)果第15頁,共49頁，2024年2月25日，星期天PCR熒光雙檢多檢試劑第16頁,共49頁，2024年2月25日，星期天熒光雙檢多檢檢測試劑原理針對同種樣本，不同的引物分別擴增不同的靶DNA，并分別被不同的特異性探針所識別，通過探針的不同熒光標記實現(xiàn)區(qū)分。特點一次性處理樣品一次性反應一次性給出2種或2種以上病原體檢測結(jié)果兩套或兩套以上擴增體系相互無信號干擾第17頁,共49頁，2024年2月25日，星期天競爭性熒光內(nèi)標(IC)定量PCR技術(shù)第18頁,共49頁，2024年2月25日，星期天競爭性熒光內(nèi)標(IC)什么是IC?

Internalcontrol簡稱IC，通常是指與靶序列十分相似的一段DNA序列，兩者在相同的條件下可被同一對引物擴增，具有相同的擴增效率；區(qū)別在于兩者的探針結(jié)合區(qū)，可分別被不同序列的探針識別，通過探針的不同熒光標記實現(xiàn)區(qū)分。IC的作用

監(jiān)控PCR反應，避免樣本抑制物、DNA（RNA）提取過程的丟失、誤操作等造成的假陰性結(jié)果；并對以上原因造成的定量誤差進行修正。第19頁,共49頁，2024年2月25日，星期天內(nèi)標工作原理圖第20頁,共49頁，2024年2月25日，星期天熒光定量PCR的臨床應用早期診斷病情評估和預后判斷抗病毒藥物療效的觀察、指導新藥驗證輸血源的篩選母嬰傳播的控制與觀察遺傳疾病的診斷腫瘤的診斷第21頁,共49頁，2024年2月25日，星期天疾病的早期診斷免疫學診斷主要是抗原抗體反應，應用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學檢測存在較長的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均長達70天，不利于對疾病的早期診斷；PCR方法直接檢測病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。第22頁,共49頁，2024年2月25日，星期天病毒感染窗口期的NAT檢測第23頁,共49頁，2024年2月25日，星期天病情評估和預后判斷通過定量檢測病毒滴度可以間接評估受侵器官或組織的炎癥發(fā)生程度以及是否發(fā)生病變；長時間機體病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往預后不好。因此對病原體的定量PCR檢測對病情和預后評估均有參考意義。第24頁,共49頁，2024年2月25日，星期天對病毒感染的藥物治療中，免疫學指標的變化通常比較滯后出現(xiàn)，且受個體差異影響較大，從而對臨床判斷難以及時提供直接證據(jù)；而熒光定量PCR檢測可直接反映病原體滴度是否受藥物治療發(fā)生變化，從而為藥物療效觀察提供直接依據(jù)，以供治療方案參考。同時對不同治療時間的用藥劑量和用藥時間提供依據(jù)?？共《舅幬锆熜У挠^察、指導第25頁,共49頁，2024年2月25日，星期天ALTAnti-HBsMonthsafterStartofTherapy0NormalAltBeforetherapy1234561224DNAHBeAgHBsAgSustainedResponsetoIFNTherapy

*HoofnagelpaperCHRONICHEPATITISB

第26頁,共49頁，2024年2月25日，星期天CHRONICHEPATITISB

ALTMonthsafterStartofTherapy0NormalAlt治療前1234561224HBVDNAHBeAgHBsAgPoorResponsetoIFNTherapy第27頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

不同劑量IFN-a單次給藥后HCV-1型病人

病毒滴度變化的定量監(jiān)測（N=32）Lametal-Hepatol26:226,1997Baseline24hours48hoursgenomes/mlx1million0246810121410MIU5MIU3MIU第28頁,共49頁，2024年2月25日，星期天新藥驗證

任何一種抗病毒藥物，以免疫標志物來評價其療效均不夠敏感和及時，若以病毒復制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和動態(tài)變化來評價療效，則較為直接和理想。第29頁,共49頁，2024年2月25日，星期天拉米夫定抑制血清HBVDHA0-20-40-60-80-100治療周數(shù)拉米夫定安慰劑血清HBVDNA;中位%變化0481216202428323640444852n=192n=404n=171n=359III期臨床研究的綜合數(shù)據(jù)第30頁,共49頁，2024年2月25日，星期天遺傳疾病的早期診斷熒光PCR可實現(xiàn)對點突變、缺失突變、插入突變、多基因突變等的檢測。對產(chǎn)前診斷具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)。第31頁,共49頁，2024年2月25日，星期天突變檢測原理

錨探針突變探針突變探針Tm值較錨探針低5℃不完全配對完全配對第32頁,共49頁，2024年2月25日，星期天突變檢測原理不完全配對完全配對溫度低 中 高第33頁,共49頁，2024年2月25日，星期天FactorV點突變檢測第34頁,共49頁，2024年2月25日，星期天ForwardPrimerReversePrimerDNACGCCGCLCRed640

LCRed705

擴增子HybprobePair1HybprobePair2雙點突變的檢測原理第35頁,共49頁，2024年2月25日，星期天雙位點雙色檢測WithoutcccWithcccMut1+Mut2WT1+WT2Het1+Het2H20F2F3第36頁,共49頁，2024年2月25日，星期天母嬰傳播的監(jiān)控

熒光PCR可對病原體的母嬰傳播進行有效的監(jiān)控，為確定宮內(nèi)感染、圍產(chǎn)期感染或哺乳期感染等提供依據(jù)，為母嬰傳播的阻斷等提供參考。第37頁,共49頁，2024年2月25日，星期天腫瘤的診斷熒光PCR的作用：可對原癌基因的突變和易位等作出檢測。可對原癌基因的mRNA進行定量分析。有利于腫瘤的早期診斷，甚至癌前診斷。探索癌變發(fā)生機理的研究提供參考。區(qū)別腫瘤的良性和惡性以及炎癥反應。第38頁,共49頁，2024年2月25日，星期天熒光PCR在血液篩查中的應用第39頁,共49頁，2024年2月25日，星期天NAT(NucleicAcidAmplificationTesting)NAT應用于血液篩查的意義血液篩查現(xiàn)狀篩查方法：免疫學輸血危險性來源：窗口期獻血，病毒變異，非典型免疫應答和實驗室檢測的失誤NAT可顯著縮短窗口期，提高輸血安全性HBV：縮短6-15天HCV：縮短41-60天HIV：縮短10-15天第40頁,共49頁，2024年2月25日，星期天急性感染時期HIV的標志物第41頁,共49頁，2024年2月25日，星期天急性感染時期HCV的標志物第42頁,共49頁，2024年2月25日，星期天急性感染時期HBV的標志物第43頁,共49頁，2024年2月25日，星期天病毒顆粒DNARNAFQ-PCRRT-FQPCR裂解熒光信號檢測核酸純化系統(tǒng)多通道熒光PCR自動檢測系統(tǒng)熒光PCR檢測流程自動加樣第44頁,共49頁，2024年2月25日，星期天多樣本混合（Minipool）規(guī)格：16-96donations“Pool”是為了加快篩查的進度和降低成本，將多袋血漿進行混合后進行檢測。“Pool”的規(guī)格取決于臨界陽性和所用NAT試劑的檢測限度。(據(jù)文獻，PEI要求歐盟所有原料血漿必須進行HCV-RNA的NAT檢測，單份血源的檢測限度應達到5000IU/ml，約1.35~2.4×104geq/ml;目前FDA要求單份血源的RNA（HIV/HCV）檢測限度應達到5000copies/ml)篩查方法：遞減法矩陣法第45頁,共49頁，2024年2月25日，星期天遞減法第46頁,共49頁，20