抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用

第三節(jié)抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用一、免疫沉淀與免疫凝集二、免疫標記三、免疫定位分析四、抗原抗體反映的其他應(yīng)用1整理課件第三節(jié)抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用一、免疫沉淀與免疫凝集1整理課件一、免疫沉淀與免疫凝集溶液中的環(huán)狀沉淀試驗在體外可溶性抗原與相應(yīng)抗體形成肉眼看見的沉淀物。在液相中形成的沉淀不容易觀察判斷，利用抗原和抗體溶液之間的界面形成的沉淀線便于觀察。2整理課件一、免疫沉淀與免疫凝集溶液中的環(huán)狀沉淀試驗2整理課件對照1:101:201:401:801:160抗血清稀釋度抗原沉淀線抗血清環(huán)狀沉淀實驗示意圖3整理課件對照1:101:202.凝膠擴散沉淀

抗原抗體在半透明的半固相介質(zhì)中進行沉淀實驗?？乖肿优c抗體分子在凝膠介質(zhì)中自由擴散，相遇形成沉淀。以瓊脂擴散實驗較為常用。單向免疫擴散：抗體混于瓊脂中，小孔中加入抗原，抗原向周圍均勻擴散，與抗體形成沉淀環(huán)?？捎糜诙繙y定免疫球蛋白和補體的含量等。雙向免疫擴散：抗原和抗體向周圍擴散后可在兩孔之間形成白色沉淀線，可用于抗原或抗體的定性檢測。缺點：時間長，靈敏度低。4整理課件2.凝膠擴散沉淀抗原抗體在半透明的半固相介質(zhì)中進行沉淀實單向免疫擴散：常用于測定IgG、IgM、IgA、C3、C4等。

抗體混于瓊脂凝膠中制板沉淀環(huán)環(huán)的直徑與抗原含量成正相關(guān)5整理課件單向免疫擴散：常用于測定IgG、IgM、IgA、C3、C4等雙向免疫擴散——沉淀線形狀的變化顯示抗原間是否存在共同的抗原決定簇。AbAg1，3AbAb6整理課件雙向免疫擴散——沉淀線形狀的變化顯示抗原間是否存在共同的抗原3.電泳條件下的沉淀反應(yīng)血清免疫電泳：患者血清和正常人血清分別放在凝膠上近負極端的小孔中進行電泳分離后，在兩種抗原之間沿電泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清進行雙擴散?；鸺娪荆簡蜗蛎庖邤U散與電泳結(jié)合的一種方法。在電場作用下抗原向正極擴散，與抗體形成沉淀峰（火箭型沉淀線）。需時短，能檢測微量抗原。對流電泳(電滲析)：在電場作用下抗原與抗體相對擴散，形成沉淀線。對流電泳較雙擴快速和靈敏。7整理課件3.電泳條件下的沉淀反應(yīng)血清免疫電泳：患者血清和正常人血清分8整理課件8整理課件9整理課件9整理課件10整理課件10整理課件4.免疫共沉淀

在溶液中兩種或兩種以上蛋白質(zhì)相互作用，可以通過免疫共沉淀驚醒鑒定和分離。蛋白質(zhì)相互作用通過非共價結(jié)合，用針對其中一種蛋白質(zhì)的特異性抗體進行的免疫沉淀，與該蛋白相互作用的其他蛋白也同時被沉淀下來。如果第一抗體結(jié)合后再加入第二抗體或A蛋白可使抗原抗體形成更大的復合物易于沉淀，也可通過加入聚乙二醇破壞水化膜加速沉淀形成。11整理課件4.免疫共沉淀在溶液中兩種或兩種以上蛋白質(zhì)相互作用，免疫共沉淀原理圖解12整理課件免疫共沉淀原理圖解12整理課件5.免疫凝集

大顆粒性抗原如細胞或細菌等與相應(yīng)的抗體結(jié)合后能使康媛顆粒發(fā)生凝集，形成肉眼易見的凝集小塊，即為免疫凝集。

凝集反應(yīng)的發(fā)生分為兩個階段：1、抗原抗體的特異性結(jié)合階段；2、出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。

13整理課件5.免疫凝集大顆粒性抗原如細胞或細菌等與相應(yīng)的抗體結(jié)合

最常見的免疫凝集反應(yīng)是紅細胞凝集，即血凝反應(yīng)。血凝反應(yīng)的抗體識別的抗原可以是紅細胞表面的天然抗原，如血凝鑒定試驗；也可以通過交聯(lián)將紅細胞連接上其他抗原，如早期的HBsAg血凝試驗。14整理課件最常見的免疫凝集反應(yīng)是紅細胞凝集，即血凝反應(yīng)。1細菌的血凝試驗常用來對細菌進行鑒定與分型，如沙門菌鞭毛抗原的分析等。免疫凝集試驗雖然簡便，但是受反應(yīng)靈敏度的限制，在實際應(yīng)用越來越少。15整理課件細菌的血凝試驗常用來對細菌進行鑒定與分型，如沙門菌鞭毛抗原二、免疫標記免疫標記技術(shù)：將已知抗體或抗原標記上易顯示的物質(zhì)（示蹤物），通過檢測標記物反映有無抗原抗體反應(yīng)，從而間接測出微量的抗原或抗體。目前有四種方法：放射免疫分析法：以同位素為示蹤物，為最靈敏、可靠的免疫標記技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）熒光與發(fā)光免疫分析親和標記的免疫分析16整理課件二、免疫標記免疫標記技術(shù)：將已知抗體或抗原標記上易顯示的物質(zhì)標記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標記靈敏性特異性標記免疫技術(shù)的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標記技術(shù)17整理課件標記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標記靈敏性特異性標記免疫技術(shù)1.放射免疫分析法標記同位素：125I，131I、3H和35S檢測方法：液相體系用液體閃爍儀計數(shù)；固相體系用X射線膠片顯影。18整理課件1.放射免疫分析法標記同位素：125I，131I、3H和35直接法與競爭法檢測檢測19整理課件直接法與競爭法檢測檢測19整理課件競爭法基本原理

采用定量的標記抗原（Ag＋）和非標記抗原（Ag）競爭性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)。20整理課件競爭法基本原理20整理課件21整理課件21整理課件放射性同位素標記分析法示意圖22整理課件放射性同位素標記分析法示意圖22整理課件23整理課件23整理課件2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

(enzymelinkedimmunosorbentassay)(1)定義：抗原與抗體吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原與抗體反應(yīng)后，將固相與液相分離除去游離的抗原或抗體，而結(jié)合的抗原或抗體上被標記的酶仍保持活性，催化底物形成有色產(chǎn)物。(2)測試方法：可目測或用分光光度計比色進行定性或定量檢測。24整理課件2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

(enzymeli(3)測試過程使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗體的形成）

在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)）25整理課件(3)測試過程使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（酶標抗原抗體復合物的分離）

加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。（顯色反應(yīng)）26整理課件用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，酶來源底物檢測波長/nm堿性磷酸酶牛小腸黏膜對硝基酚磷酸鹽405過氧化物酶辣根鄰苯二胺/過氧化氫492β-半乳糖酶大腸桿菌對硝基酚β-半乳糖405常用標記的酶及其底物27整理課件酶來源底物檢測波長/nm堿性磷酸酶牛小腸黏膜對硝基酚磷酸鹽4(4)ELISA技術(shù)類型

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標記的抗原或抗體，酶作用的底物。28整理課件(4)ELISA技術(shù)類型ELISA可用于測定抗①雙抗體夾心法(直接夾心法）29整理課件①雙抗體夾心法(直接夾心法）29整理課件特點：非競爭結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇30整理課件特點：30整理課件②間接法31整理課件②間接法31整理課件32整理課件32整理課件③捕獲法（反向間接法）主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定。33整理課件③捕獲法（反向間接法）主要用于血清中某種抗體亞型成分（如Ig④直接法用酶標記的抗原或抗體直接檢測包被在酶標板上的抗體或抗原，其量與產(chǎn)物顏色成正比。34整理課件④直接法34整理課件3、均相酶免疫吸附測定

基本原理：利用酶標抗體結(jié)合抗原形成復合物后，標記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復合物與游離酶標抗體分離的情況下，直接測定系統(tǒng)中總的標記酶活性的改變，進而推算出待檢樣品中的抗原量。

主要用于小分子抗原或半抗原的檢測.35整理課件3、均相酶免疫吸附測定基本原理：利用酶標抗體結(jié)合抗原形成復酶放大免疫測定技術(shù):

（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）基本原理:半抗原與酶結(jié)合成酶標半抗原，保留半抗原和酶的活性。當酶標半抗原與抗體結(jié)合后，所標的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受影響而活性被抑制。36整理課件酶放大免疫測定技術(shù):

（enzyme-multiplied⑤斑點酶免疫試驗

(dot-ELISA)37整理課件⑤斑點酶免疫試驗(dot-ELISA)37整理課件3.熒光與發(fā)光免疫分析概念：以熒光素作為示蹤物，通過熒光顯微鏡觀察進行定位檢測。熒光化合物：異硫氰熒光素、羅丹明熒光素。38整理課件3.熒光與發(fā)光免疫分析概念：以熒光素作為示蹤物，通過熒光顯基本原理

利用熒光素標記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標本中的待檢抗原特異結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點光源，透過濾色板發(fā)出一定波長的光，使結(jié)合在標本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來判斷有無待檢抗原或抗體。39整理課件基本原理39整理課件40整理課件40整理課件熒光免疫測定技術(shù)——

時間分辨熒光免疫分析法原理：稀土銪離子Eu3+螯合物標記抗體后，抗體與固相抗原結(jié)合，抗體上的Eu3+在紫外光（340nm）激發(fā)下，與增強液中的β-二酮體重新形成一種微膠體螯合物，發(fā)出長壽命的高強度熒光（613nm），比未激發(fā)時增強了100萬倍，可用時間分辯熒光計記錄。41整理課件熒光免疫測定技術(shù)——

時間分辨熒光免疫分析法原理：稀土銪離子EuEuEuEuEu發(fā)射高強度熒光時間分辯熒光計記錄加入增強液紫外光激發(fā)（340nm）時間分辨熒光免疫分析原理直接法間接法夾心法間接夾心法42整理課件EuEuEuEuEu發(fā)射高強度熒光時間分辯熒光計記錄加入增強4.親和標記的免疫分析親和標記物：金黃色葡萄球菌的A蛋白、生物素（維生素）、地高辛（小分子藥物）原理：金黃色葡萄球菌的A蛋白與IgG的Fc有高度親和力。用酶、同位素和熒光素等標記A蛋白，與抗體結(jié)合，可用于抗原抗體反應(yīng)的分析。43整理課件4.親和標記的免疫分析親和標記物：金黃色葡萄球菌的A蛋白、生A蛋白

親和標記的免疫分析44整理課件A蛋白

親和標記的免疫分析44整理課件三、免疫定位分析1.免疫熒光定位分析2.酶標記免疫定位3.免疫電子顯微鏡技術(shù)45整理課件三、免疫定位分析1.免疫熒光定位分析45整理課件1.免疫熒光定位分析用不同發(fā)光顏色的熒光化合物標記抗體用于免疫細胞化學、免疫組織化學檢測。（熒光化合物+抗體）生物大分子（抗原）在細胞或組織中的表達和定位熒光素：異硫氰熒光素、異硫氰四甲基羅丹明熒光顯微鏡觀測熒光激活細胞分揀器（流式細胞儀）應(yīng)用：CD4+、CD8+T細胞亞群計數(shù)原理：流式細胞儀產(chǎn)生分析的電信號生要是光散射信號和熒光信號，流式細胞儀依據(jù)細胞流經(jīng)光照射區(qū)時電壓訊號的強弱來分析和分選細胞。46整理課件1.免疫熒光定位分析用不同發(fā)光顏色的熒光化合物標記抗體用于免47整理課件47整理課件48整理課件48整理課件2.酶標記免疫定位抗原（組織或細胞內(nèi)）+第一抗體+第二抗體酶+底物——不溶于水的有色產(chǎn)物（1）酶標免疫組織化學固相抗原為組織切片或細胞樣品。49整理課件2.酶標記免疫定位抗原（組織或細胞內(nèi)）+第一抗體+第二抗體酶（2）免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳后，形成不同的條帶，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用酶標記的抗體進行顯色反應(yīng)，可確定目的蛋白的有無，或分子量大小。分三個階段進行:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）轉(zhuǎn)移——硝酸纖維素膜酶免疫定位

50整理課件（2）免疫印跡法（immunoblottingtest，IB免疫印跡法原理示意圖

51整理課件免疫印跡法原理示意圖51整理課件3.免疫電子顯微鏡（IEM）技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)與免疫反應(yīng)相結(jié)合的一項技術(shù)。優(yōu)點：提高了電鏡觀察的特異性。如形態(tài)相同，但結(jié)構(gòu)和組成不同的生物粒子，細胞器或病毒粒子。種類：一類是先用抗體捕捉抗原，然后用磷鎢酸負染色觀察。另一類是用金標記抗體進行抗原定位。膠體金與抗體Fc段結(jié)合。52整理課件3.免疫電子顯微鏡（IEM）