實(shí)驗(yàn)一二三四DNA重組技術(shù)

質(zhì)粒提取限制性內(nèi)切酶酶切瓊脂糖凝膠電泳核酸的體外連接膠回收1編輯ppt質(zhì)粒提取限制性內(nèi)切酶酶切瓊脂糖凝膠電泳核酸的體外連接膠回收1

堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA

2編輯ppt堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA2編輯ppt一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?/p>

質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。其復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。3編輯ppt一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?/p>

質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1k質(zhì)粒的應(yīng)用質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。4編輯ppt質(zhì)粒的應(yīng)用4編輯ppt本實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)要求掌握最常用的質(zhì)粒的提取方法。5編輯ppt本實(shí)驗(yàn)?zāi)康?編輯ppt分離質(zhì)粒DNA方法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的堿變性法；煮沸法；SDS法；

各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟(jì)且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化。6編輯ppt分離質(zhì)粒DNA方法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常1.溶菌酶2.堿裂解：

SDS,NaOHpH12.0-12.53.中和：

pH4.8醋酸鈉

溶菌，釋放DNA蛋白質(zhì)、DNA變性中和、質(zhì)粒DNA復(fù)性堿變性法基本原理7編輯ppt1.溶菌酶溶菌，釋放DNA蛋白質(zhì)、DNA變性中和、質(zhì)粒D堿變性法基本原理在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。8編輯ppt堿變性法基本原理在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的實(shí)驗(yàn)方法

１．挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至5mlLB培養(yǎng)液中（含AmP50μg/ml），３７℃強(qiáng)烈搖蕩過度。２．取1.5ml培養(yǎng)液至Eppendorf管中，12000g離心30秒，棄上清３．將細(xì)菌沉淀懸浮于250μl預(yù)冷溶液Ⅰ（已加入RNA酶）中，振蕩混勻。４．加入250μl溶液Ⅱ，蓋嚴(yán)管蓋輕柔顛倒５次以混勻內(nèi)容物。５．加入350μl溶液Ⅲ，溫和顛倒數(shù)次。６．12000g離心8分鐘，取上清移到吸附柱中離心1分鐘。9編輯ppt實(shí)驗(yàn)方法

１．挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至5mlLB培養(yǎng)液中

７．加入700μl70%乙醇，１２000g離心1分鐘。8.重復(fù)79.１２000g離心2分鐘10．加入50μl洗脫液至吸附膜中央，１２000g離心1分鐘。11．取10μlDNA溶解液加2μlLoadingbuffer于1%瓊脂糖電泳。12．電泳凝膠在透射式紫外檢測(cè)儀上觀察。10編輯ppt７．加入700μl70%乙醇，１２000g離心1分鐘注意事項(xiàng)

1.菌濃度，OD值2.P1充分重懸菌體沉淀3.P2裂菌時(shí)間不超過5min，動(dòng)作溫和。4.洗滌后充分離心11編輯ppt注意事項(xiàng)

1.菌濃度，OD值11編輯pptＤＮＡ的酶切

12編輯pptＤＮＡ的酶切

12編輯ppt一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?/p>

核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)，用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲。限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的ＤＮＡ片段５’端為Ｐ，３’端為ＯＨ。13編輯ppt一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?/p>

核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈ＤＮＡ中限制酶根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。Ⅰ類和Ⅲ類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴ATP的限制性內(nèi)切酶活性。Ⅰ類限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識(shí)別位點(diǎn)，且沒有特定的切割位點(diǎn)，酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)切割，很難形成穩(wěn)定的特異性切割末端。Ⅲ類限制性內(nèi)切酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割，然后從底物上解離下來。故Ⅰ類和Ⅲ類酶在基因工程中基本不用。14編輯ppt限制酶根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活Ⅱ型酶Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性內(nèi)切酶.它們能識(shí)別雙鏈ＤＮＡ的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識(shí)別順序一般為４～６個(gè)堿基對(duì)的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序；Ⅱ型內(nèi)切酶切割雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)生３種不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，才使得人們能在體外有目的地對(duì)遺傳物質(zhì)ＤＮＡ進(jìn)行改造，從而極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。15編輯pptⅡ型酶15編輯ppt酶切反應(yīng)注意事項(xiàng)：１．內(nèi)切酶：不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染；內(nèi)切酶的用量根據(jù)內(nèi)切酶單位和ＤＮＡ用量而定，通常1u指在適當(dāng)條件下，1小時(shí)內(nèi)完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性內(nèi)切酶量，使用中一般以１ugDNA對(duì)２－３u酶短時(shí)間為宜。同時(shí)內(nèi)切酶體積不能超過反應(yīng)體系１０％，因內(nèi)切酶中含５０％甘油，體系中甘油超過５％會(huì)抑制內(nèi)切酶活力；內(nèi)切酶操作應(yīng)在低溫下進(jìn)行（冰上）；使用時(shí)防止操作中對(duì)內(nèi)切酶的污染。16編輯ppt酶切反應(yīng)注意事項(xiàng)：１．內(nèi)切酶：16編輯ppt２．ＤＮＡ：作為內(nèi)切酶底物，ＤＮＡ應(yīng)該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高鹽濃度、酒精等，這些因素的存在均不同程度影響限制性內(nèi)切酶的活力。這種抑制可通過：增加酶作用單位數(shù)（10~20U/ugDNA）、增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制劑或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間加以克服。17編輯ppt２．ＤＮＡ：作為內(nèi)切酶底物，ＤＮＡ應(yīng)該具備一定的純度，其溶液３．反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+組成，其中Mg2+為內(nèi)切酶輔基；Tris·HCl維持反應(yīng)體系pH值在7.2-7.6之間；NaCl濃度不同形成３種級(jí)別的離子強(qiáng)度：低鹽（10mMNaCl)中鹽（50mMNaCl）高鹽（100mMNaCl）不同的內(nèi)切酶選擇特定的反應(yīng)緩沖液。18編輯ppt３．反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液主要由Tris·HCl、NaCl、４．酶解溫度與時(shí)間：大多數(shù)限制酶反應(yīng)溫度為３７℃，如EcoRⅠ,HindⅢ,BamHⅠ,PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)酶的單位與ＤＮＡ用量之比來定。一般２小時(shí)即可充分酶解。19編輯ppt４．酶解溫度與時(shí)間：大多數(shù)限制酶反應(yīng)溫度為３７℃，如EcoR質(zhì)粒5-8μl10

buffer1.5μl15μl體系中

E10.25μl

E20.25μlddH2O：

5-8μl1.酶切體系步驟20編輯ppt質(zhì)粒

２．將反應(yīng)體系充分混勻，并于臺(tái)式離心機(jī)上短暫離心。３．Eppendorf管于３７℃水管中反應(yīng)２小時(shí)。４．反應(yīng)結(jié)束后加入Loadingbuffer終止反應(yīng)。５．?。?μl于１％瓊脂糖凝膠上電泳。６．紫外透射儀上檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果。21編輯ppt２．將反應(yīng)體系充分混勻，并于臺(tái)式離心機(jī)上短暫離心。21編輯瓊脂糖凝膠電泳原理

1.DNA、RNA的多核苷酸鏈中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，帶負(fù)電.磷酸戊糖重復(fù)性決定了遷移速率取決于分子的大小和構(gòu)型.2.不同濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)分離分子量大小不同的DNA片斷3.EB顯色!!!22編輯ppt瓊脂糖凝膠電泳原理1.DNA、RNA的多瓊脂糖凝膠電泳試劑1、

5×TBE（5倍體積的TBE貯存液）配1000ml5×TBE：Tris54g硼酸27.5g0.5mol/lEDTA20ml（pH8.0）2、

凝膠加樣緩沖液（6×）溴酚藍(lán)0.25%蔗糖40%3、

瓊脂糖4、

溴化乙錠溶液（EB）0.5μg/ml23編輯ppt瓊脂糖凝膠電泳試劑23編輯ppt瓊脂糖凝膠電泳步驟（一）

制備瓊脂糖凝膠稱取0.3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30ml0.5×TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1%瓊脂糖凝膠液，按100ml的凝膠加5μl的EB。（二）膠板的制備

1.將有機(jī)玻璃槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。2.將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。3.待膠凝固后，加入電泳緩沖液至電泳槽中。4.取出梳子。（三）加樣（四）電泳DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1~2cm處，停止電泳。

瓊脂糖凝膠濃度/%線性DNA的有效分離范圍/kb0.35~600.6 1~200.70.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~42.00.1~324編輯ppt瓊脂糖凝膠電泳步驟（一）

制備瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠濃度/注意事項(xiàng)合適的凝膠濃度正確的電泳方向瓊脂糖凝膠電泳25編輯ppt注意事項(xiàng)瓊脂糖凝膠電泳25編輯ppt膠回收步驟1.切膠,稱重2.溶膠3.過柱4.洗滌5.洗脫注意事項(xiàng)26編輯ppt膠回收步驟1.切膠,稱重注意事項(xiàng)26編輯ppt核酸的體外連接原理

T4噬菌體DNA連接酶：粘性末端的DNA分子連接平末端的雙鏈DNA分子連接連接體系：線性化載體2μl片斷6μl10

ligasebuffer1μlT4ligase1μl12-16℃過夜27編輯ppt核酸的體外連接原理線性化載體1、DNA連接酶用量與DNA片段的性質(zhì)有關(guān)，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。

2、在連接帶有粘性末端的DNA片段時(shí)，DNA濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時(shí)，需加入DNA濃度至100-200mg/ml。

3、連接反應(yīng)后，反應(yīng)液在0℃儲(chǔ)存數(shù)天，-80℃儲(chǔ)存2個(gè)月，但是在-20℃冰凍保存將會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管T4DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，在連接粘性末端時(shí)，反應(yīng)溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。

5、在連接反應(yīng)中，如不對(duì)載體分子進(jìn)行去5‘磷酸基處理，使用過量的外源DNA片段（2-5倍），這將有助于減少載體的自身環(huán)化，增加外源DNA和載體連接的機(jī)會(huì)。

注意事項(xiàng)核酸的體外連接28編輯ppt1、DNA連接酶用量與DNA片段的性質(zhì)有關(guān)，連接平齊末端，必

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

的制備和轉(zhuǎn)化

29編輯ppt大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

的制備和轉(zhuǎn)化

29編輯一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?/p>

轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。所謂感受態(tài)，就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。30編輯ppt一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?/p>

轉(zhuǎn)化(Transformation)是將學(xué)習(xí)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，并通過轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入DNA。

31編輯ppt學(xué)習(xí)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，并通過轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入DNA實(shí)驗(yàn)原理在進(jìn)行基因克隆時(shí)，體外構(gòu)建的DNA重組子必須導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，才可以復(fù)制，增殖和表達(dá)。載體與外源目的基因構(gòu)成的重組載體可以通過轉(zhuǎn)化直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因在異源細(xì)胞的表達(dá)。進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，要求細(xì)胞處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)，即感受態(tài)，重組分子才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。32編輯ppt實(shí)驗(yàn)原理在進(jìn)行基因克隆時(shí)，體外構(gòu)建的DNA重組子必須導(dǎo)入合適通過CaCl2

處理的大腸桿菌細(xì)胞就是一種感受態(tài)細(xì)胞。在0℃冷凍處理時(shí)，處于CaCl2低滲溶液中的大腸桿菌細(xì)胞膨脹成球形。DNA可吸附于其表面。在短暫的熱沖擊下，細(xì)胞吸收外源DNA，然后在豐富培養(yǎng)基內(nèi)復(fù)原并增殖，表達(dá)外源基因。33編輯ppt通過CaCl2處理的大腸桿菌細(xì)胞就是一種感受態(tài)細(xì)胞。在0帶有選擇標(biāo)記基因的外源載體在受體細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)時(shí)，受體細(xì)胞表現(xiàn)標(biāo)記基因的表型，使轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子在選擇培養(yǎng)基上區(qū)分開來。34編輯ppt帶有選擇標(biāo)記基因的外源載體在受體細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)時(shí)，受體細(xì)胞表現(xiàn)材料、試劑及器具

1、

材料E.coliDH5α轉(zhuǎn)化產(chǎn)物2、

試劑（1）0.1mol/LCaCl2（滅菌）。（2）LB液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基。（3）氨芐青霉素（Amp）：用無菌水配制成100mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。35編輯ppt材料、試劑及器具35編輯ppt3、器具（1）超凈工作臺(tái)。（2）恒溫水浴鍋。（3）恒溫?fù)u床、培養(yǎng)箱。36編輯ppt3、器具36編輯ppt

操作步驟

感受態(tài)細(xì)胞的制備

從大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)平板上挑取一個(gè)單菌落接于

2mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

↓

以1%的接種量將以上過夜培養(yǎng)物接種于液體培養(yǎng)基中

↓

37℃振蕩培養(yǎng)2～3h

↓

將菌液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，冰上放置10min

↓

37編輯ppt

操作步驟

感受4000rpm，離心10min回收細(xì)胞

↓

用冰冷的0.1mol/LCaCl21mL，懸