基因工程原理與技術(shù)-5課件

第五章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)

PCR是體外快速擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列的技術(shù)

1971年Khorana等提出“在體外經(jīng)DNA變性，與適當(dāng)引物雜交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA”的設(shè)想。

1983年Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)。1988年Saiki等將耐熱TaqDNA聚合酶引入了PCR技術(shù)。1989年P(guān)CR被美國(guó)《Science》雜志列為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首。

1993年Mullis榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

應(yīng)用領(lǐng)域：生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)及考古學(xué)。

1編輯版pppt第五章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1編輯版pppt第一節(jié)PCR原理①遵循DNA體內(nèi)復(fù)制原理，半保留式擴(kuò)增；②擴(kuò)增序列取決于設(shè)計(jì)一對(duì)引物(正向引物、反向引物)，有效擴(kuò)增長(zhǎng)度為2kb左右；③擴(kuò)增循環(huán)包含變性、退火、延伸3個(gè)階段；④30~35個(gè)循環(huán)后，目標(biāo)序列呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增(2n-2)Cycle#12編輯版pppt第一節(jié)PCR原理Cycle#12編輯版pppt第二節(jié)PCR反應(yīng)體系一、反應(yīng)體系20μl

反應(yīng)體系10×buffer(Tris-HCl、KCl、Tween20、明膠、牛血清蛋白)dNTP(各20~200μmol/L)模板DNA(0.1~2μg=105個(gè)分子)引物(各20~200pmol)MgCl2(0.5~2.5mmol/L)TaqDNA聚合酶(1~2.5U)無(wú)菌ddH2O3編輯版pppt第二節(jié)PCR反應(yīng)體系20μl反應(yīng)體系10×buff二、反應(yīng)參數(shù)

預(yù)變性：94℃3~5min變性：94℃30~60S退火：38~65℃30~60S延伸：72℃1~2min

終延伸：72℃10min

30~35次循環(huán)4編輯版pppt二、反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性：94℃3~5m三、影響PCR的因素1、反應(yīng)成分①引物；濃度、長(zhǎng)度②DNA聚合酶；種類(Klenow酶、Taq酶、Pfu酶)、用量

③dNTP；濃度、比例④Mg2+；影響TaqDNA聚合酶的活性和真實(shí)性、引物退火、模板解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體生成等。

⑤反應(yīng)緩沖液；pH8.3，KCl能促使引物退火、但濃度大于50mmol/L抑制酶活性。

⑥模板DNA。用量，線性DNA擴(kuò)增效果大于環(huán)狀DNA。5編輯版pppt三、影響PCR的因素5編輯版pppt2、反應(yīng)條件①變性的溫度和時(shí)間；熱啟動(dòng)降低非特異性擴(kuò)增

②退火的溫度和時(shí)間；取決于引物的長(zhǎng)度、濃度和堿基組成，退火溫度為Tm-5℃。退火溫度越高，擴(kuò)增特異性越高。

③延伸溫度和時(shí)間。延伸時(shí)間長(zhǎng)短取決于目標(biāo)序列的長(zhǎng)度、及延伸溫度的高低。對(duì)2kb長(zhǎng)目標(biāo)序列擴(kuò)增時(shí)間多采用1min(72℃時(shí))。6編輯版pppt2、反應(yīng)條件6編輯版pppt四、平臺(tái)效應(yīng)

平臺(tái)效應(yīng)是指PCR反應(yīng)后期擴(kuò)增產(chǎn)物不再隨循環(huán)次數(shù)而明顯上升、反應(yīng)曲線變得平坦的現(xiàn)象。

7編輯版pppt四、平臺(tái)效應(yīng)7編輯版pppt

引起平臺(tái)效應(yīng)的因素：

①dNTP或引物等消耗殆盡；

②酶活性逐漸降低；

③最終產(chǎn)物的阻化作用(焦磷酸鹽、雙鏈DNA)；

④非特異性產(chǎn)物與模板的競(jìng)爭(zhēng)作用；

⑤在高產(chǎn)物濃度下產(chǎn)物變性不完全；

⑥低濃度的非特異產(chǎn)物開(kāi)始大量擴(kuò)增。

PCR的特點(diǎn)：

①靈敏度高

②簡(jiǎn)便、快速

③對(duì)樣品純度要求低

8編輯版pppt引起平臺(tái)效應(yīng)的因素：8編輯版pppt第三節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物設(shè)計(jì)原則一、引物設(shè)計(jì)的總原則

提高特異性擴(kuò)增，降低非特異性擴(kuò)增。二、引物設(shè)計(jì)的一般原則①引物長(zhǎng)度應(yīng)為15~30個(gè)核苷酸，Tm接近72℃較佳；Tm＝(G＋C)×4＋(A＋T)×2

②引物中堿基分布應(yīng)是隨機(jī)的，避免出現(xiàn)一連串單一堿基以致產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)；

③G＋C堿基的含量在45％~55％左右；

④引物3’端必須與模板互補(bǔ)，5’端可以不互補(bǔ)⑤引物中連續(xù)互補(bǔ)堿基應(yīng)小于4個(gè)；⑥引物間連續(xù)互補(bǔ)堿基應(yīng)小于4個(gè)。

9編輯版pppt第三節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物設(shè)計(jì)原則9編輯版pppt三、引物3’端的末位堿基

引物3’端的未位堿基：優(yōu)選A，其次是G、C，不要選T。因?yàn)楫?dāng)未位堿基為T時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下也能引發(fā)鏈的合成；而未位堿基為A時(shí)，錯(cuò)配時(shí)的引發(fā)效率大大降低；若為G或C，則引發(fā)率居于其間。當(dāng)然，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物時(shí)，3’端末位堿基選T會(huì)得到較好的效果。四、引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6.57

Primer5.0

10編輯版pppt三、引物3’端的末位堿基10編輯版pppt第四節(jié)PCR的類型一、已知DNA序列的PCR擴(kuò)增1、巢式PCR

不受平臺(tái)效應(yīng)限制，擴(kuò)增靈敏度增加1000倍，

引物1引物225個(gè)循環(huán)引物3引物425個(gè)循環(huán)11編輯版pppt第四節(jié)PCR的類型引物1引物225個(gè)循環(huán)引物3引物42、熱巢式PCR

第二對(duì)引物之一標(biāo)記放射性物質(zhì)，電泳檢測(cè)時(shí)靈敏度增高，可測(cè)出106個(gè)細(xì)胞中的一個(gè)DNA分子。

3、半巢式PCR

(見(jiàn)下圖)引物1引物225個(gè)循環(huán)25個(gè)循環(huán)引物1引物312編輯版pppt2、熱巢式PCR引物1引物225個(gè)循環(huán)25個(gè)循環(huán)引物1引物34、不對(duì)稱PCR采用兩種不同濃度的引物(50:1)。主要用于制備DNA測(cè)序的單鏈模板以及制備雜交探針。高濃度引物低濃度引物13編輯版pppt4、不對(duì)稱PCR高濃度引物低濃度引物13編輯版pppt5、等位特異性PCR

用于檢測(cè)點(diǎn)突變。在引物的3’端設(shè)計(jì)了突變堿基，突變引物與正常模板間擴(kuò)增受阻，電泳分析時(shí)，不出現(xiàn)譜帶，反之則會(huì)出現(xiàn)特定譜帶。但有些錯(cuò)配堿基不能完全阻止引物延伸。6、競(jìng)爭(zhēng)引物PCR

用于檢測(cè)特定位點(diǎn)的點(diǎn)突變。設(shè)計(jì)兩個(gè)等位特異性引物，一個(gè)是正常的，另一個(gè)是突變引物，而且突變堿基在引物中間，其擴(kuò)增產(chǎn)物相差20倍以上。由于一個(gè)引物被標(biāo)記，能檢測(cè)出不同樣品的的擴(kuò)增差異。

常為A/A、G/G、G/A、C/A、C/C、T/C、T/G。14編輯版pppt5、等位特異性PCR14編輯版pppt7、降落PCR

在一次PCR中，設(shè)計(jì)多循環(huán)反應(yīng)的程序，第一個(gè)程序的退火溫度高于Tm，以后每個(gè)程序的退火溫度逐漸降低，確保第一次擴(kuò)增的特異性，這樣后面的低退火溫度不會(huì)影響擴(kuò)增的特異性，因?yàn)樵陂_(kāi)始的幾個(gè)循環(huán)中，目標(biāo)產(chǎn)物已指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。常用于根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的擴(kuò)增、多基因家族成員的擴(kuò)增。

15編輯版pppt7、降落PCR15編輯版pppt二、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄PCR是指先以mRNA，以oligo(dT)n為引物在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈，然后用已知一對(duì)引物擴(kuò)增cDNA片段的技術(shù)。主要用于基因表達(dá)、cDNA克隆、逆轉(zhuǎn)錄病毒鑒定等研究。反轉(zhuǎn)錄PCR16編輯版pppt二、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)反轉(zhuǎn)錄PCR16編輯版ppRT-PCR引物設(shè)計(jì)原則：

①引物限定區(qū)最好為180~500bp；②引物5’和3’端不應(yīng)存在回文序列結(jié)構(gòu)；

③用oligo(dT)n作逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA的引物時(shí)，有義引物應(yīng)盡量位于RNA的3’端；④在引物限定區(qū)內(nèi)，基因組DNA最好有一內(nèi)含子，這樣可檢測(cè)污染情況；⑤PCR引物限定區(qū)內(nèi)最好有一酶切位點(diǎn)，以便鑒定產(chǎn)物；

17編輯版ppptRT-PCR引物設(shè)計(jì)原則：17編輯版pppt三、快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE，錨定PCR)雜合引物:17ntoligo(dT)(錨定引物)+帶限制酶位點(diǎn)的序列?；蛱禺愐?’RACE的缺點(diǎn)：不能獲得真正的5’末端。因?yàn)檫^(guò)早終止第一鏈cDNA像全長(zhǎng)cDNA一樣，可被末端轉(zhuǎn)移酶同樣有效地加尾。

3’RACE5’RACE18編輯版pppt三、快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE，錨定PCR)雜合引物:新5’RACE(加帽法)雜合引物RNA、RNA連接酶5’RACE煙草酸性焦磷酸酶

19編輯版pppt新5’RACE(加帽法)雜合引物RNA、RNA連接酶5’RA四、已知序列的側(cè)翼未知序列的PCR擴(kuò)增1、反向PCR

酶切位點(diǎn)已知序列酶切稀釋并分子內(nèi)連接引物PCR在已知序列內(nèi)酶切PCR20編輯版pppt四、已知序列的側(cè)翼未知序列的PCR擴(kuò)增酶切位點(diǎn)已知序列酶切稀2、鍋柄PCR

酶切、磷酸酶處理連接單連引物加Taq酶和dNTP，變性鏈內(nèi)復(fù)性（稀釋）鏈延伸鏈延伸巢式PCR已知序列引物巢式PCR21編輯版pppt2、鍋柄PCR酶切、磷酸酶處理連接單連引物加Taq酶和dN五、未知序列PCR擴(kuò)增1、差異顯示PCR

錨定引物N9：隨機(jī)引物22編輯版pppt五、未知序列PCR擴(kuò)增錨定引物N9：隨機(jī)引物22編輯版ppp2、減法PCR例如：受試者為感病材料；驅(qū)動(dòng)者為正常材料23編輯版pppt2、減法PCR例如：受試者為感病材料；驅(qū)動(dòng)者為正常材料23編六、熒光定量PCR(實(shí)時(shí)定量PCR)熒光染料(EB)：結(jié)合雙鏈DNA會(huì)使熒光增強(qiáng)，但結(jié)合無(wú)特異性。

熒光標(biāo)記探針(見(jiàn)圖)：利用Taq酶的外切酶活性，擴(kuò)增時(shí)切斷探針釋放出熒光基團(tuán)，使熒光增強(qiáng)。特異性強(qiáng)

用途：檢測(cè)病原菌、基因表達(dá)。

R：熒光基團(tuán)；Q：淬滅基團(tuán)24編輯版pppt六、熒光定量PCRR：熒光基團(tuán)；Q：淬滅基團(tuán)24編輯版p第五節(jié)PCR技術(shù)應(yīng)用一、基因克隆及篩選二、基于PCR分子標(biāo)記RAPD、SSR、AFLP等，應(yīng)用在遺傳圖譜構(gòu)建、生物進(jìn)化、遺傳多樣性等方面的研究。三、DNA測(cè)序四、突變檢測(cè)五、基因表達(dá)檢測(cè)六、病原菌檢測(cè)與疾病診