蛋白質(zhì)工程重點(diǎn)

關(guān)于蛋白質(zhì)工程重點(diǎn)基因工程和蛋白質(zhì)工程第2頁,共154頁，2024年2月25日，星期天1、蛋白質(zhì)工程的基本研究內(nèi)容蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

——基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計(jì)和預(yù)測

——基礎(chǔ)的應(yīng)用與驗(yàn)證創(chuàng)造和/或改造蛋白質(zhì)——新蛋白質(zhì)

——終目標(biāo)第3頁,共154頁，2024年2月25日，星期天一、基本化學(xué)組件氨基酸amino肽單位和多肽鏈peptideunit,polypeptidechain

第4頁,共154頁，2024年2月25日，星期天氨基酸性質(zhì)極性氨基酸：Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、His、Tyr、Trp

——二硫鍵疏水氨基酸：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Met——疏水內(nèi)核荷電氨基酸：Arg、Lys（+）；Asp、Glu（-）——PI，蛋白分離光譜特性、紫外線吸收特性——檢測第5頁,共154頁，2024年2月25日，星期天氨基酸的構(gòu)型與構(gòu)象構(gòu)型configuration：一個(gè)分子中原子的特定空間排布（L-型的單一手性分子）構(gòu)象conformation：組成分子的原子或基團(tuán)繞單鍵旋轉(zhuǎn)而形成的不同空間排布旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體rotamer：以優(yōu)勢構(gòu)象（交錯(cuò)構(gòu)象staggedconformation）出現(xiàn)的氨基酸殘基（用于模建）肽鍵peptidebond:由一個(gè)氨基酸的

-羧基與另一個(gè)氨基酸的

-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵。具有反式(trans)和順式(cis)兩種構(gòu)型第6頁,共154頁，2024年2月25日，星期天多肽鏈構(gòu)象的表征參數(shù)（1）扭角(torsionangle)或雙面角(dihedralangle)系統(tǒng)（2）多肽鏈的構(gòu)象角(,)（3）拉氏構(gòu)象圖（Ramachandraplot）及多肽鏈構(gòu)象的允許區(qū)第7頁,共154頁，2024年2月25日，星期天二、空間結(jié)構(gòu)組件α螺旋αhelixβ層βsheet環(huán)肽鏈loop轉(zhuǎn)角turn第8頁,共154頁，2024年2月25日，星期天α-螺旋結(jié)構(gòu)（α-helix）多肽鏈中的各個(gè)肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個(gè)氨基酸殘基；兩個(gè)氨基酸之間的距離為0.15nm;肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個(gè)氨基酸殘基的酰胺基團(tuán)的-CO基與第四個(gè)氨基酸殘基酰胺基團(tuán)的-NH基形成氫鍵。蛋白質(zhì)分子為右手

-螺旋。第9頁,共154頁，2024年2月25日，星期天兩親性amphipathicity螺旋一側(cè)主要分布親水（荷電、極性）殘基，另一側(cè)主要集中疏水殘基可用螺旋轉(zhuǎn)輪(helicalwheel)的方式預(yù)測對(duì)生物活性具有重要作用疏水內(nèi)核solventexcludedcore蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有的一個(gè)共同特征疏水內(nèi)核是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力疏水內(nèi)核是天然蛋白質(zhì)穩(wěn)定的基本結(jié)構(gòu)因素第10頁,共154頁，2024年2月25日，星期天β-折疊(β-sheet)

折疊的幾種形式1.平行型2.反平行型3.混合型扭轉(zhuǎn)的肽鏈twistedstrand：鏈都是沿其前進(jìn)方向不斷扭轉(zhuǎn)，從而使實(shí)際蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的層都不是平直的，而是一種扭轉(zhuǎn)層。右手扭轉(zhuǎn)第11頁,共154頁，2024年2月25日，星期天環(huán)肽鏈（loop)1．回折(reverseturn)（1）β轉(zhuǎn)折（轉(zhuǎn)角）(-turn)在

-轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基酸殘基組成;彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的-C=O和第四個(gè)殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中（2）γ轉(zhuǎn)折(γ-turn):由3個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的轉(zhuǎn)折2．β發(fā)夾（1）β發(fā)夾(β－h(huán)airpin)通過一段短的環(huán)鏈將2條相鄰的鏈連接在一起環(huán)鏈可具有不同的長度（1～4，2）常具有重要的功能性意義（2）β凸起(β－bulge)第12頁,共154頁，2024年2月25日，星期天環(huán)肽鏈的意義連接二級(jí)結(jié)構(gòu)元素的主要結(jié)構(gòu)因素，在三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測中，環(huán)鏈區(qū)構(gòu)象的確定具有基本的重要性環(huán)鏈區(qū)常常出現(xiàn)在生物活性位置，三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建具有功能意義環(huán)肽鏈結(jié)構(gòu)庫——用于結(jié)構(gòu)預(yù)測和模建第13頁,共154頁，2024年2月25日，星期天三、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)層次一級(jí)結(jié)構(gòu)（primerystructure）二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondarystructure)結(jié)構(gòu)模體(motif)結(jié)構(gòu)域(domain）三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiarystructure)/亞基（subunit）四級(jí)結(jié)構(gòu)(quaternarystructure)第14頁,共154頁，2024年2月25日，星期天1.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)primerystructure多肽鏈中氨基酸的排列序列同源(homology)2.蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)secondarystructure多肽鏈主鏈骨架中的若干肽段，各自沿著某個(gè)軸盤旋或折疊，并以氫鍵維系，從而形成有規(guī)則的構(gòu)象，不涉及氨基酸殘基的側(cè)鏈構(gòu)象。

α-螺旋（α-helix）

β-折疊(β-sheet)β-轉(zhuǎn)角(β-turn)β-凸起（β-burgle）無規(guī)則卷曲（randomcoil）第15頁,共154頁，2024年2月25日，星期天3.結(jié)構(gòu)模體

（supersecondarystructure，motif）

介于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的空間結(jié)構(gòu),指相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，排列形成規(guī)則的、在空間結(jié)構(gòu)上能夠辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體，并充當(dāng)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)件（blockbuilding），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。第16頁,共154頁，2024年2月25日，星期天4.結(jié)構(gòu)域domain是在二級(jí)結(jié)構(gòu)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)，一條多肽鏈在這個(gè)域范圍內(nèi)來回折疊，但相鄰的域常被一個(gè)或兩個(gè)多肽片段連結(jié)。通常由50-300個(gè)氨基酸殘基組成，其特點(diǎn)是在三維空間可以明顯區(qū)分和相對(duì)獨(dú)立，并且具有一定的生物功能如結(jié)合小分子。模體或基序（motif）是結(jié)構(gòu)域的亞單位通常由2～3二級(jí)結(jié)構(gòu)單位組成，一般為α螺旋、β折疊和環(huán)（loop）。第17頁,共154頁，2024年2月25日，星期天5.三級(jí)結(jié)構(gòu)tertiarystructure

在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再折疊ABCA胰島素的三級(jí)結(jié)構(gòu)B溶菌酶分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)C磷酸丙糖異構(gòu)酶三級(jí)結(jié)構(gòu)C丙酮酸激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)D第18頁,共154頁，2024年2月25日，星期天6.四級(jí)結(jié)構(gòu)quaternarystructure亞基聚合而成的寡聚蛋白結(jié)構(gòu)側(cè)重強(qiáng)調(diào)亞基之間的相互作用和空間排布情況均一、非均一；對(duì)稱、不對(duì)稱亞基(subunit)1)蛋白質(zhì)分子的最小共價(jià)單位2)具有完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)3)是四級(jí)結(jié)構(gòu)的基本組件4)均一、非均一第19頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)類型——α型——

型——α/

型——α＋

型——無規(guī)型／富含二硫鍵和金屬離子型第20頁,共154頁，2024年2月25日，星期天維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力鹽鍵又稱鹽橋或離子鍵（ionicbond):正電荷與負(fù)電荷之間的一種靜電相互作用。氫鍵(hydrogenbond):多肽主鏈上的羰基氧和酰胺氫之間、側(cè)鏈與側(cè)鏈、側(cè)鏈與介質(zhì)水、主鏈肽基與側(cè)鏈或主鏈肽基與水之間形成。疏水作用（hydrophobicinteraction):介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向與把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)方面占有突出地位。范德華力(vanderwaalsforce）：指分子間的作用力。廣義上的范德華力包括3種較弱的作用力：定向效應(yīng)，誘導(dǎo)效應(yīng)，分散效應(yīng)。二硫鍵（disulfidebond）絕大多數(shù)情況下二硫鍵是在多肽鏈的β－轉(zhuǎn)角附近形成的第21頁,共154頁，2024年2月25日，星期天二、蛋白質(zhì)折疊的概念蛋白質(zhì)的折疊proteinfolding從體內(nèi)新生的多肽鏈或體外變性的多肽鏈的一維線性氨基酸序列轉(zhuǎn)化為具有特征三維結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)的過程。折疊研究：研究蛋白質(zhì)特定三維空間結(jié)構(gòu)形成的規(guī)律、穩(wěn)定性和與其生物活性的關(guān)系。蛋白質(zhì)復(fù)性：將蛋白質(zhì)從結(jié)構(gòu)不規(guī)則、無活性的狀態(tài)，恢復(fù)到有唯一立體結(jié)構(gòu)、有生物活性的狀態(tài)的過程。蛋白質(zhì)變性：蛋白質(zhì)在一定的理化條件下會(huì)失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及部分理化特性等稱為變性第22頁,共154頁，2024年2月25日，星期天1、“自組裝學(xué)說”

（self-assembly）

20世紀(jì)60年代，Anfinsen基于還原變性的牛胰RNase在不需其他任何物質(zhì)幫助下，僅通過去除變性劑和還原劑就使其恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出了“多肽鏈的氨基酸序列包含了形成其熱力學(xué)上穩(wěn)定的天然構(gòu)象所必需的全部信息”的“自組裝學(xué)說”。1965，中國，化學(xué)合成活性結(jié)晶牛胰島素Anfinsen，1972，NobelPrice第23頁,共154頁，2024年2月25日，星期天2?！盁崃W(xué)假說”天然蛋白質(zhì)多肽采取的構(gòu)象是在一定環(huán)境條件下熱力學(xué)上最穩(wěn)定的結(jié)果，采取天然構(gòu)象的多肽鏈和它所處的一定環(huán)境條件（如溶液組分、pH、溫度、離子強(qiáng)度等）整個(gè)系統(tǒng)的自由能最低，所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈在一定的環(huán)境條件下能夠自發(fā)折疊成天然構(gòu)象。第24頁,共154頁，2024年2月25日，星期天3、“輔助性組裝學(xué)說”體內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊往往需要有其他輔助因子的參與，并伴隨有ATP的水解不僅僅受“熱力學(xué)”控制，也受到“動(dòng)力學(xué)”的控制二者是統(tǒng)一的二者所起作用大小在不同的蛋白質(zhì)中可能不同1987年，Ellis第25頁,共154頁，2024年2月25日，星期天新支持三維結(jié)構(gòu)的形成是一個(gè)同時(shí)進(jìn)行著的，協(xié)調(diào)的動(dòng)態(tài)過程。（1988，鄒承魯）90年代輔助蛋白(Accessory

protein)的發(fā)現(xiàn)——細(xì)胞內(nèi)新生肽段的折疊一般意義上說是需要幫助的，而不是自發(fā)進(jìn)行的。第26頁,共154頁，2024年2月25日，星期天二、幫助蛋白質(zhì)和新生肽鏈折疊的生物大分子分子伴侶（molecularchaperone）是一類相互之間有關(guān)系的蛋白，它們的功能是幫助其他含多肽結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在體內(nèi)進(jìn)行正確的非共價(jià)的組裝，并且不是組裝完成的結(jié)構(gòu)在發(fā)揮其正常的生物功能時(shí)的組成部分(1993,Ellis)折疊酶：催化與折疊直接有關(guān)的化學(xué)反應(yīng)的酶。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(proteindisulfideisomerase,PDI)肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidylprolylcis-transisomerase,PPI)第27頁,共154頁，2024年2月25日，星期天分子伴侶的定義完全是功能上的。分子伴侶與酶的異同點(diǎn)相同點(diǎn)參與促進(jìn)一個(gè)反應(yīng)而本身并不在最終產(chǎn)物中出現(xiàn)不同點(diǎn)分子伴侶對(duì)靶蛋白不具有高度專一性分子伴侶的催化效率很低分子伴侶有時(shí)只是阻止肽鏈的錯(cuò)誤折疊而不是促進(jìn)其正確折疊。第28頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)折疊的特點(diǎn)不是一步形成的，而是通過一些中間折疊物而完成的。新生肽鏈的不完整性形成最終成熟蛋白分子中不存在也不應(yīng)該有的瞬間結(jié)構(gòu)。在大分子擁擠的環(huán)境下經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊。折疊中間態(tài)的正確途徑與錯(cuò)誤途徑競爭失敗時(shí)。第29頁,共154頁，2024年2月25日，星期天分子伴侶在蛋白質(zhì)分子折疊中的作用識(shí)別折疊過程中形成的折疊中間物的非天然結(jié)構(gòu)。與這些中間物結(jié)合，生成復(fù)合物，防止過早的或者錯(cuò)誤的相互作用而阻止不正確的無效的折疊途徑，抑制不可逆的聚合物的產(chǎn)生，促進(jìn)折疊向正確的有效的途徑進(jìn)行。分子伴侶首先會(huì)識(shí)別折疊過程中形成的折疊中間物的非天然構(gòu)象，而不會(huì)去理會(huì)天然構(gòu)象。分子伴侶與早期形成的中間物相互作用而防止它們之間的聚合；一旦聚合形成，分子伴侶就無能為力了?？梢哉f分子伴侶能“治病救人”，但并無“起死回生”的絕招。第30頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)催化新生肽鏈的巰基氧化形成二硫鍵。PDI首先和含有巰基的肽鏈結(jié)合。PDI對(duì)含有二硫鍵蛋白折疊的底物特異性不高。通過二硫鍵的交換，PDI可幫助蛋白快速找到可以達(dá)到的熱力學(xué)上最穩(wěn)定狀態(tài)的二硫鍵對(duì)。PDI含有兩個(gè)Cys-Gly-His-Cys序列，并且Cys上的巰基是非常活性的.PDI在動(dòng)力學(xué)錯(cuò)配折疊中間體加速二硫鍵的交換中起到非常重要的作用。第31頁,共154頁，2024年2月25日，星期天肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPI)蛋白質(zhì)的肽鍵幾乎都是反式的（99.95%），但脯氨酰亞氨基的肽鍵有6%是順式的。脯氨酰亞氨基異構(gòu)是很多蛋白體外折疊過程中的限速步驟。PPI可以提高脯氨酰亞氨基順反異構(gòu)300倍的效率。第32頁,共154頁，2024年2月25日，星期天第一遺傳密碼遺傳信息的傳遞—從核酸序列到功能蛋白質(zhì)的全過程。第一遺傳密碼—三聯(lián)遺傳密碼3個(gè)相連的核苷酸順序決定蛋白質(zhì)分子肽鏈中的一個(gè)氨基酸。第二遺傳密碼現(xiàn)有的遺傳密碼僅有從核酸序列到無結(jié)構(gòu)的多肽鏈的信息傳遞，因此是不完整的。無結(jié)構(gòu)的多肽鏈到有完整結(jié)構(gòu)的功能蛋白質(zhì)信息傳遞部分—遺傳密碼的第二部分，即蛋白質(zhì)中氨基酸序列與其三維結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，稱之為第二遺傳密碼或折疊密碼第33頁,共154頁，2024年2月25日，星期天第二遺傳密碼的特點(diǎn)簡并性氨基酸序列不同的肽鏈可以有極為相似甚至相同的三維結(jié)構(gòu)。多意性相同的氨基酸序列可以在不同的條件下決定不同的三維結(jié)構(gòu)。全局性在肽鏈上相距很遠(yuǎn)的殘基可以在空間上彼此靠近而相互作用，并對(duì)分子總體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響；后形成的肽段可以影響已經(jīng)形成的肽段個(gè)構(gòu)象從而造成對(duì)分子整體的影響等。第34頁,共154頁，2024年2月25日，星期天與蛋白錯(cuò)誤折疊有關(guān)的疾病蛋白傳染子導(dǎo)致的疾?。╬riondiseases）淀粉樣蛋白病（amyloiddiseases）癌癥（cancer）第35頁,共154頁，2024年2月25日，星期天常見“折疊病”老年性癡呆癥(Alzheimersyndrome)病人腦中充滿了由錯(cuò)誤折疊蛋白形成的雜亂的蛋白質(zhì)簇。主要分為兩類：含有沉淀樣β蛋白（Aβ）的沉淀樣斑，tau蛋白引起的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)自損傷。帕金森氏癥（Parkinsondisease）主要是由于蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，病人隨意運(yùn)動(dòng)的控制能力逐漸喪失，因?yàn)槟墚a(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞逐步被破壞，其原因和發(fā)生機(jī)制尚不清楚。某些腫瘤抑癌基因突變?cè)斐梢职┗蚓幋a的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變引起的一些癌癥的發(fā)生。p53穩(wěn)定性的降低導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。第36頁,共154頁，2024年2月25日，星期天三、折疊機(jī)制的理論模型▲框架模型（FrameworkModel）

框架模型假設(shè)蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象依賴于局部的氨基酸序列。在多肽鏈折疊過程的起始階段,先迅速形成不穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元；稱為“flickeringcluster”,隨后這些二級(jí)結(jié)構(gòu)靠近接觸,從而形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)框架；最后，二級(jí)結(jié)構(gòu)框架相互拼接，肽鏈逐漸緊縮，形成了蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。這個(gè)模型認(rèn)為即使是一個(gè)小分子的蛋白也可以一部分一部分的進(jìn)行折疊,其間形成的亞結(jié)構(gòu)域是折疊中間體的重要結(jié)構(gòu)。第37頁,共154頁，2024年2月25日，星期天▲疏水塌縮模型（HydrophobicCollapseModel）

在疏水塌縮模型中，疏水作用力被認(rèn)為是在蛋白質(zhì)折疊過程中起決定性作用的力的因素。在形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之前首先發(fā)生很快的非特異性的疏水塌縮?！杷畠?nèi)核包埋

三、折疊機(jī)制的理論模型

第38頁,共154頁，2024年2月25日，星期天▲擴(kuò)散-碰撞-粘合機(jī)制（Diffusion-Collision-AdhesionModel）

該模型認(rèn)為蛋白質(zhì)的折疊起始于伸展肽鏈上的幾個(gè)位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)上生成不穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元或者疏水簇，主要依靠局部序列的進(jìn)程或中程（3-4個(gè)殘基）相互作用來維系。它們以非特異性布朗運(yùn)動(dòng)的方式擴(kuò)散、碰撞、相互黏附，導(dǎo)致大的結(jié)構(gòu)生成并因此而增加了穩(wěn)定性。進(jìn)一步的碰撞形成具有疏水核心和二級(jí)結(jié)構(gòu)的類熔球態(tài)中間體的球狀結(jié)構(gòu)。球形中間體調(diào)整為致密的、無活性的類似天然結(jié)構(gòu)的高度有序熔球態(tài)結(jié)構(gòu)。最后無活性的高度有序熔球態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾挠谢盍Φ奶烊粦B(tài)。三、折疊機(jī)制的理論模型

第39頁,共154頁，2024年2月25日，星期天▲成核-凝聚-生長模型（Nuclear-Condensation-GrowthModel）

根據(jù)這種模型，肽鏈中的某一區(qū)域可以形成“折疊晶核”，以它們?yōu)楹诵?，整個(gè)肽鏈繼續(xù)折疊進(jìn)而獲得天然構(gòu)象。所謂“晶核”實(shí)際上是由一些特殊的氨基酸殘基形成的類似于天然態(tài)相互作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這些殘基間不是以非特異的疏水作用維系的，而是由特異的相互作用使這些殘基形成了緊密堆積。晶核的形成是折疊起始階段限速步驟。三、折疊機(jī)制的理論模型

第40頁,共154頁，2024年2月25日，星期天▲拼版模型（Jig-SawPuzzleModel）

此模型的中心思想就是多肽鏈可以沿多條不同的途徑進(jìn)行折疊,在沿每條途徑折疊的過程中都是天然結(jié)構(gòu)越來越多,最終都能形成天然構(gòu)象,而且沿每條途徑的折疊速度都較快,與單一途徑折疊方式相比,多肽鏈速度較快,另一方面,外界生理生化環(huán)境的微小變化或突變等因素可能會(huì)給單一折疊途徑造成較大的影響，而對(duì)具有多條途徑的折疊方式而言,這些變化可能給某條折疊途徑帶來影響,但不會(huì)影響另外的折疊途徑,因而不會(huì)從總體上干擾多肽鏈的折疊,除非這些因素造成的變化太大以致于從根本上影響多肽鏈的折疊。三、折疊機(jī)制的理論模型

第41頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目的意義為蛋白質(zhì)工程提供指導(dǎo)性信息探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)制

——蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容之一第42頁,共154頁，2024年2月25日，星期天常見設(shè)計(jì)目標(biāo)提高蛋白的熱、酸穩(wěn)定性增加活性降低副作用提高專一性進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究……

第43頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)及解決辦法

第44頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)流程根據(jù)結(jié)構(gòu)或功能需求，從天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)出發(fā)，確定突變位點(diǎn)及替換的氨基酸；預(yù)測修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；預(yù)測新蛋白質(zhì)可能的性質(zhì)；實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；循環(huán)至達(dá)到目標(biāo)第45頁,共154頁，2024年2月25日，星期天分子設(shè)計(jì)的步驟（1）建立所研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型（2）找出對(duì)所要求的性質(zhì)有重要影響的位置（3）選擇一系列的在（2）中所選出位點(diǎn)上改變殘基所得到的突變體（4）預(yù)測突變體的結(jié)構(gòu)（5）定性或定量計(jì)算優(yōu)化所得到的突變體結(jié)構(gòu)是否具有所要求的性質(zhì)第46頁,共154頁，2024年2月25日，星期天設(shè)計(jì)應(yīng)注意問題應(yīng)確定對(duì)蛋白質(zhì)折疊敏感的區(qū)域：帶有特殊扭角的氨基酸、鹽橋、密堆積區(qū)應(yīng)確定對(duì)功能非常重要的位置：結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系應(yīng)考慮剩余位置對(duì)所希望改變的影響當(dāng)進(jìn)行互換或插入/刪除殘基時(shí)應(yīng)考慮它們對(duì)結(jié)構(gòu)特征的影響第47頁,共154頁，2024年2月25日，星期天功能殘基鑒定根據(jù)結(jié)構(gòu)信息序列同源性分析實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段隨機(jī)突變刪除分析及連接段掃描突變第48頁,共154頁，2024年2月25日，星期天Sample1:胰島素的改造常規(guī)胰島素的缺點(diǎn):在高于生理濃度(10-8~10-10mol/L)自身聚合[藥用濃度高,>10-4mol/L]發(fā)揮生理功能需要單體形式與專一受體結(jié)合解決途徑基于IGF-1是以單體形式存在,將胰島素B鏈的B28-B29的殘基序列顛倒成IGF-1相應(yīng)序列向胰島素二聚體形成面引入帶電荷或具有大的側(cè)鏈的殘基,以阻礙二聚體的形成第49頁,共154頁，2024年2月25日，星期天Sample2:酶分子的定向進(jìn)化定點(diǎn)突變等基因改造技術(shù)，改變蛋白序列中的個(gè)別氨基酸殘基，可以對(duì)酶的性質(zhì)和其催化特性進(jìn)行改造，產(chǎn)生符合特定需要的酶，這一蛋白質(zhì)工程技術(shù)又稱為分子進(jìn)化的理性設(shè)計(jì)。第50頁,共154頁，2024年2月25日，星期天人胰島素的生產(chǎn)方法直接提取法制人胰島素化學(xué)合成法制人胰島素化學(xué)轉(zhuǎn)型法制人胰島素在pH為6-7的有機(jī)相中使胰蛋白酶催化其逆反應(yīng)，該酶在過量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素B鏈C末端的丙氨酸交換下來，所形成的人胰島素叔丁酯再用三氯乙酸脫去叔丁酯基團(tuán)，最終獲得人胰島素?；蛑亟M法重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別，而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點(diǎn)第51頁,共154頁，2024年2月25日，星期天第52頁,共154頁，2024年2月25日，星期天定點(diǎn)突變和隨機(jī)突變其代表性的方法

定點(diǎn)方法舊的使用RE的片段改組盒式突變新的寡核苷酸定點(diǎn)突變PCR為基礎(chǔ)的點(diǎn)突變隨機(jī)方法舊隨機(jī)方法紫外線

X射線

其他化學(xué)方法新的隨機(jī)方法轉(zhuǎn)座子簡并引物PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變使用引物情況利用引物在基因的5’末端和3’末端產(chǎn)生定點(diǎn)突變利用引物在目的基因的中心區(qū)段產(chǎn)生定點(diǎn)突變第53頁,共154頁，2024年2月25日，星期天KaryB.Mullis"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"

TheNobelPrizeinChemistry1993MichaelSmith定點(diǎn)突變第54頁,共154頁，2024年2月25日，星期天引物設(shè)計(jì)原則①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。②產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。③引物長度一般在15~30堿基之間。④G+C含量在40%~60%之間。⑤堿基要隨機(jī)分布。⑥引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。⑦引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。⑧引物5′端可以修飾。⑨引物3′端不可修飾。⑩引物3′端要避開密碼子的第3位。

第55頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)融合表達(dá)的主要方法重組基因直接剪接于適當(dāng)信號(hào)肽之后將外源按閱讀框架自我融合目標(biāo)蛋白在與其融合的蛋白伙伴序列的C端或N端融合分泌親和融合雙親和融合分泌插入融合第56頁,共154頁，2024年2月25日，星期天改造蛋白質(zhì)的方法物理、化學(xué)法：對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性、復(fù)性處理，修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈官能團(tuán)，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進(jìn)蛋白質(zhì)形成一定的立體構(gòu)像等等。生物化學(xué)法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學(xué)基團(tuán)，利用轉(zhuǎn)酰胺酶使蛋白質(zhì)發(fā)生膠連等等。第57頁,共154頁，2024年2月25日，星期天分子生物學(xué)途徑：①利用體外重組或PCR技術(shù)進(jìn)行定位突變（插入/刪除/替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基）；②基因融合和剪接：將編碼一種蛋白質(zhì)的部分基因移植到另一種蛋白質(zhì)基因上或?qū)⒉煌鞍踪|(zhì)基因的片段組合在一起，經(jīng)基因克隆和表達(dá)，產(chǎn)生出新的融合蛋白質(zhì)。改造蛋白質(zhì)的方法第58頁,共154頁，2024年2月25日，星期天改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的核心技術(shù)——

基因的人工定點(diǎn)突變

插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；替換或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。

——重組DNA技術(shù)或PCR方法第59頁,共154頁，2024年2月25日，星期天1.M13載體法(Kunkel突變法)人工合成帶突變位點(diǎn)的寡聚核苷酸作為引物將待研究的基因插入載體M13，制得單鏈模板，合成相應(yīng)的互補(bǔ)鏈，用T4連接酶連接成閉環(huán)雙鏈分子。（制備單鏈DNA常用菌株是M13噬菌體）經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，雙鏈分子在胞內(nèi)分別復(fù)制，因此就得到兩種類型的噬菌斑，含錯(cuò)配堿基的就為突變型。再轉(zhuǎn)入合適的表達(dá)系統(tǒng)合成突變型蛋白質(zhì)。

經(jīng)此擴(kuò)增出來的基因有1/2是突變了的基因，經(jīng)一定的篩選便可獲得突變基因。第60頁,共154頁，2024年2月25日，星期天2.重組PCR定點(diǎn)誘變法

利用兩個(gè)互補(bǔ)的帶有突變堿基的內(nèi)側(cè)引物及兩個(gè)外側(cè)引物，先進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，獲得兩條彼此重疊的DNA片段。兩條片段由于具有重疊區(qū)，因此在體外變性和復(fù)性后可形成兩種不同的異源雙鏈DNA分子，其中一種帶有３’凹險(xiǎn)末端的DNA可通過Taq酶延伸而形成帶有突變位點(diǎn)的全長基因。該基因再利用兩個(gè)外側(cè)引物進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)增，便可獲得人工定點(diǎn)突變的基因。3.大引物誘變法

利用一個(gè)帶突變位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)引物與一個(gè)外側(cè)引物先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再以擴(kuò)增產(chǎn)物作為引物與另一個(gè)外側(cè)引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增而獲得人工定點(diǎn)突變的全長基因。第61頁,共154頁，2024年2月25日，星期天4.盒式突變

(cassettemutagenesis)1985年Wells提出特點(diǎn)：區(qū)域性的突變，又稱片段取代法(DNAfragmentreplacement)。要點(diǎn)：是利用目標(biāo)基因中所具有的適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，用具有任何長度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段來置換或取代目標(biāo)基因上的一段DNA序列。優(yōu)勢：一次處理就可以得到多種突變型基因。第62頁,共154頁，2024年2月25日，星期天5.硫代負(fù)鏈法核苷酸間磷酸基的氧被硫替代后修飾物（α－（S）－dCTP）對(duì)某些內(nèi)切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成負(fù)鏈，然后用內(nèi)切酶處理，結(jié)果僅在正鏈上產(chǎn)生“缺口”，用核苷酸外切酶III從3｀→5｀擴(kuò)大缺口并超過負(fù)鏈上錯(cuò)配的核苷酸，在聚合酶作用下修復(fù)正鏈，就可以得到二條鏈均為突變型的基因。第63頁,共154頁，2024年2月25日，星期天1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)方法

—從頭設(shè)計(jì)二級(jí)結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝配體誘導(dǎo)組裝通過共價(jià)交叉連接實(shí)現(xiàn)肽的自組裝在合成模板上肽的組裝線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)第64頁,共154頁，2024年2月25日，星期天①二級(jí)結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝模塊設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)合成單一二級(jí)結(jié)構(gòu)單元（α螺旋或折疊股）作為多肽鏈的片段的模塊，然后復(fù)制這些二級(jí)結(jié)構(gòu)模塊并把它們連接為整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。優(yōu)點(diǎn)：簡單、直接、容易合成缺點(diǎn)：穩(wěn)定性依賴于濃度、結(jié)構(gòu)簡單重復(fù)第65頁,共154頁，2024年2月25日，星期天②配體誘導(dǎo)自組裝典型的是以金屬離子作為配體將配體結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)在結(jié)構(gòu)中幾個(gè)相互作用片段的界面處如果這個(gè)位點(diǎn)對(duì)配體有很高的親和力，則結(jié)合配體的合適的自由能將充分克服熵消耗并肽自組裝第66頁,共154頁，2024年2月25日，星期天③通過共價(jià)交叉連接實(shí)現(xiàn)肽的自組裝二硫鍵DAB法：8股-barrel中形成簡單的從上到下的連接方法肽鍵：賴氨酸的側(cè)鏈基團(tuán)以及谷氨酸、天冬氨酸的側(cè)鏈羧酸彼此間形成肽鍵；或者與主鏈的N端或C端形成肽鍵適用于設(shè)計(jì)由平行或反平行二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組成的結(jié)構(gòu)第67頁,共154頁，2024年2月25日，星期天④在合成模板上肽的組裝模板組裝合成蛋白法（TASPs,Mutter）使用人工模板形成turn或loop特點(diǎn)：每條肽鏈顯示最低限度的濃度倚賴關(guān)系，但是一旦它們連接到模板上，它們的結(jié)構(gòu)傾向于穩(wěn)定并且不依賴于年度優(yōu)點(diǎn)：能模擬天然蛋白質(zhì)的性質(zhì)第68頁,共154頁，2024年2月25日，星期天⑤線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)最小化途徑：把全新設(shè)計(jì)的復(fù)雜性簡化為幾個(gè)涉及天然蛋白穩(wěn)定性的關(guān)鍵特征，然后優(yōu)化這些特征。內(nèi)堆積因素“負(fù)設(shè)計(jì)”：設(shè)計(jì)一個(gè)互補(bǔ)的不穩(wěn)定的競爭結(jié)構(gòu)第69頁,共154頁，2024年2月25日，星期天⑥基于組合庫的全新設(shè)計(jì)“二元模式”通過合成基因在細(xì)菌中表達(dá)制備，同時(shí)通過基因編碼實(shí)現(xiàn)組合多樣性。疏水核堆積優(yōu)化、二級(jí)結(jié)構(gòu)單元間界面優(yōu)化計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)方法第70頁,共154頁，2024年2月25日，星期天抗體人源化體現(xiàn)的蛋白質(zhì)工程的思想

蛋白質(zhì)工程是以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過化學(xué)、物理和分子生物學(xué)的手段進(jìn)行基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行定向改造，設(shè)計(jì)、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比自然存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類對(duì)生產(chǎn)和生活的需要的新型蛋白質(zhì)鼠源性抗體有以下缺點(diǎn)：應(yīng)用于人體可產(chǎn)生人抗小鼠抗體；其次鼠源性抗體通常不能有效地激活人體的生物效應(yīng)功能；此外其次鼠源性抗體在人體內(nèi)的半衰期也短為了克服以上缺點(diǎn)，對(duì)鼠源性抗體進(jìn)行了從人-鼠嵌合抗體到改形抗體到表面重塑抗體到抗體庫技術(shù)優(yōu)化人改形抗體

的不斷改良與優(yōu)化的人源化過程第71頁,共154頁，2024年2月25日，星期天(1)人-鼠嵌合抗體

人-鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)連接起來并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)而得到的抗體。人-鼠嵌合抗體的特點(diǎn)含75～80%人抗體，20%鼠抗體。恒定區(qū)是人源性的，大大降低了HAMA。可有效激活CDC和ADCC。可變區(qū)為鼠源，保留了親本單抗的親和力和特異性。在人體內(nèi)的半衰期明顯延長。第72頁,共154頁，2024年2月25日，星期天(2)改形抗體（CDR移植抗體）CDR移植抗體(CDRgraftingantibody)即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改形抗體，也就是人源化抗體。改形抗體的特點(diǎn)與人-鼠嵌合抗體相比抗原性進(jìn)一補(bǔ)降低但仍有可能產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體在保持抗原結(jié)合活性與降低免疫原性之間有難以調(diào)和的矛盾第73頁,共154頁，2024年2月25日，星期天(3)表面重塑抗體將鼠單抗可變區(qū)表面暴露的骨架區(qū)氨基酸殘基中與人可變區(qū)相應(yīng)的氨基酸殘基改為人源的，就可以使可變區(qū)表面人源化，消除了異源性而不影響可變區(qū)的整體空間構(gòu)象，這種對(duì)鼠單抗進(jìn)行人源改造的方式稱表面氨基酸殘基的“人源化”。

第74頁,共154頁，2024年2月25日，星期天

抗體庫技術(shù)優(yōu)化人改形抗體

先通過分子結(jié)構(gòu)分析找出可能影響抗原結(jié)合部位立體結(jié)構(gòu)的骨架區(qū)殘基，將這些殘基的鼠源副本和人源副本同時(shí)組合到一個(gè)抗體庫中，或?qū)⑦@些殘基隨機(jī)化，通過篩選過程尋找最佳組合，確定哪些位置需要保留親本鼠源殘基。如，抗原表位定向選擇：以鼠單抗可變區(qū)為模板，利用噬菌體展示技術(shù)，通過抗原導(dǎo)向，篩選能夠模擬鼠單抗可變區(qū)，結(jié)合相同抗原決定簇的人抗體(4)通過抗體庫技術(shù)人源化第75頁,共154頁，2024年2月25日，星期天抗體人源化體現(xiàn)的蛋白質(zhì)工程的思想而此人源化過程的目的：從鼠源性抗體的恒定區(qū)人源化到可變區(qū)的最大限度人源化，恰好與蛋白質(zhì)工程對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行定向改造，設(shè)計(jì)、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比自然存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類對(duì)生產(chǎn)和生活的需要的新型蛋白質(zhì)的思想不謀而合第76頁,共154頁，2024年2月25日，星期天體外蛋白質(zhì)折疊與

細(xì)胞內(nèi)新生肽鏈折疊的區(qū)別完整肽鏈在試管內(nèi)的重折疊相當(dāng)于翻譯完成后才折疊，與新生肽鏈的合成延伸與折疊同時(shí)進(jìn)行的不同。細(xì)胞內(nèi)新生肽鏈折疊是一個(gè)比蛋白質(zhì)體外重折疊快得多的過程。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的溫度大約在37℃附近，pH值一般在中性范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)體外復(fù)性一般會(huì)降低溫度甚至直到4℃。而且針對(duì)不同的蛋白所選用的pH值范圍也很不同。細(xì)胞和試管另一個(gè)重要差別是“大分子擁擠”問題。第77頁,共154頁，2024年2月25日，星期天

體外：體外蛋白合成系統(tǒng)

原核表達(dá)系統(tǒng)

–

大腸桿菌,芽孢桿菌

體內(nèi)酵母

真核表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞

動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物重組表達(dá)系統(tǒng)的類型及其優(yōu)缺點(diǎn)

第78頁,共154頁，2024年2月25日，星期天重組表達(dá)系統(tǒng)的類型及其優(yōu)缺點(diǎn)

第79頁,共154頁，2024年2月25日，星期天重組表達(dá)系統(tǒng)的類型及其優(yōu)缺點(diǎn)

第80頁,共154頁，2024年2月25日，星期天2.原核（大腸桿菌）表達(dá)載體的組件2.1復(fù)制起始點(diǎn)2.2選擇性基因2.3多克隆位點(diǎn)2.4啟動(dòng)子2.5終止子2.6核糖體結(jié)合位點(diǎn)第81頁,共154頁，2024年2月25日，星期天2.真核（哺乳動(dòng)物細(xì)胞）表達(dá)載體的組件哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體有2大類：質(zhì)粒型載體和病毒型載體（一）質(zhì)粒型載體

哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)是通過細(xì)菌質(zhì)粒而獲得的，主要是在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入了一些病毒或其他一些物種及人的基因表達(dá)調(diào)控序列。目前有多種質(zhì)粒載體可供選擇。（二）病毒型載體

病毒型載體已被廣泛地用于將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞或替換哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的缺陷基因，這類載體將來在基因治療中將具有非常重要的價(jià)值。（目前應(yīng)用的病毒類型包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等）典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體需要以下作用元件:

(1)啟動(dòng)子，(2)多聚腺苷酸化信號(hào)，(3)選擇標(biāo)記和(4)幾個(gè)原核作用元件，如細(xì)菌抗生素選擇標(biāo)記和用于質(zhì)粒擴(kuò)增的復(fù)制子（具有原核作用元件才能作為原核細(xì)胞和真核細(xì)胞之間的穿梭質(zhì)粒）等。第82頁,共154頁，2024年2月25日，星期天

3.1

包涵體型異源蛋白的表達(dá)

3.2可溶性異源蛋白的表達(dá)3.外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)第83頁,共154頁，2024年2月25日，星期天包涵體及其性質(zhì)在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子3.1包涵體型異源蛋白的表達(dá)第84頁,共154頁，2024年2月25日，星期天

包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)

1。在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集

2。簡化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來

3。能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白3.1包涵體型異源蛋白的表達(dá)第85頁,共154頁，2024年2月25日，星期天包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)

以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變性復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)物的收率至關(guān)重要。

經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性，有時(shí)甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過30%

復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。3.1包涵體型異源蛋白的表達(dá)第86頁,共154頁，2024年2月25日，星期天1.原則以合理的效率、速度、收率和純度，將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞的全部其他成分特別是不想要的雜蛋白中分離出來，同時(shí)仍保留其生物學(xué)活性和化學(xué)完整性。2.步驟選擇實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的粗分級(jí)蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)蛋白質(zhì)的鑒定第87頁,共154頁，2024年2月25日，星期天3.分離方法沉淀法相分配法電泳法離心法超濾法層析法第88頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的粗分級(jí)使用蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實(shí)驗(yàn)材料后，蛋白提取液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度往往較低，采取一些簡單的方法使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃縮，同時(shí)去除大量的雜質(zhì)，這些純化方法就屬于蛋白質(zhì)的粗分級(jí)。硫酸銨分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀、超速離心、等電點(diǎn)沉淀、透析、超過濾、蛋白質(zhì)結(jié)晶等。第89頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會(huì)沉淀析出，稱為鹽析鹽析原理：高濃度鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水化水，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水膜，同時(shí)鹽離子也會(huì)影響蛋白質(zhì)分子所帶電荷，從而引起蛋白質(zhì)沉淀，但通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。如，硫酸銨分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)分子表面的疏水性區(qū)域，都聚集許多氺分子，當(dāng)鹽類加入時(shí)，這些氺分子被抽出，以便于鹽離子進(jìn)行氺合，暴露出來的疏水性區(qū)域互相結(jié)合，形成沉淀。第90頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)粗分級(jí)只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離純化，多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、分子形狀、分子表面特稱或分子帶電狀況進(jìn)一步純化，這就是蛋白質(zhì)細(xì)分級(jí)。常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)：層析和電泳第91頁,共154頁，2024年2月25日，星期天層析分離方法第92頁,共154頁，2024年2月25日，星期天1.1分子篩層析

Gelfiltrationchromatography原理分子篩層析,也稱為凝膠過濾、分子排阻層析。是以多孔性凝膠材料為支持物，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液流經(jīng)此支持物時(shí)，分子大小不同的蛋白質(zhì)所受到的阻滯作用不同而先后流出，從而達(dá)到分離純化的目的。

分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)難以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，因此主要從凝膠顆粒的間隙里通過，所受到的阻滯作用小，分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)則容易進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，所受到的阻滯作用大，因此大分子蛋白質(zhì)先流出凝膠，而小分子蛋白質(zhì)后流出凝膠，從而將分子質(zhì)量大小不同的蛋白質(zhì)分開凝膠介質(zhì)葡聚糖（glucose）瓊脂糖（agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纖維素（cellulose）第93頁,共154頁，2024年2月25日，星期天1.2離子交換層析（Ionexchange）原理蛋白質(zhì)是兩性分子，在一定的pH條件下帶有電荷，不同的蛋白質(zhì)帶有的電荷的種類和數(shù)量不同，因此它們與帶電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同。利用蛋白質(zhì)和帶電凝膠的作用力的差別從而把蛋白質(zhì)分開的層析方法。種類陽離子交換柱：凝膠帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)帶正電荷陰離子交換柱：凝膠帶正電荷，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷介質(zhì)惰性支持物：瓊脂糖，葡聚糖帶電基團(tuán)：羧甲基—帶負(fù)電二乙基氨基—帶正電平衡離子：負(fù)電基團(tuán)的平衡離子氫或鈉離子正電基團(tuán)的平衡離子氫氧根離子或氯離子第94頁,共154頁，2024年2月25日，星期天1.3親和層析

（Affinitychromatography）原理親合層析是利用蛋白質(zhì)與配體專一性識(shí)別并結(jié)合的特性而分離蛋白質(zhì)的一種層析方法。將與目標(biāo)蛋白質(zhì)專一性結(jié)合的配體固定于支持物上，當(dāng)混合樣品流過此支持物時(shí)，只有目標(biāo)蛋白能與配體專一性結(jié)合，而其他雜蛋白不能結(jié)合。先用結(jié)合緩沖液洗脫雜蛋白，然后改變洗脫條件，將目標(biāo)蛋白洗脫下來。第95頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)組（proteome）Proteome＝PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)）。一個(gè)基因組、一種生物或一種細(xì)胞/組織所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)第96頁,共154頁，2024年2月25日，星期天二、電泳（Electrophoresis）原理：不同的物質(zhì)由于其帶電性質(zhì)及其顆粒大小和形狀不同，在一定的電場中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度不同，故此可使它們分離。種類：SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）（由于SDS是陰離子，使多肽表面覆蓋的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了原來的電荷差異，使移動(dòng)速度只和顆粒大小和形狀相關(guān)。）等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing-IEF）雙向電泳（TwoDimensionalElectrophoresis

）第97頁,共154頁，2024年2月25日，星期天包涵體及其性質(zhì)在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子3.1包涵體型異源蛋白的表達(dá)第98頁,共154頁，2024年2月25日，星期天

包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)

1。在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集

2。簡化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來

3。能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白3.1包涵體型異源蛋白的表達(dá)第99頁,共154頁，2024年2月25日，星期天包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)

以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變性復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)物的收率至關(guān)重要。

經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性，有時(shí)甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停话悴怀^30%

復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。3.1包涵體型異源蛋白的表達(dá)第100頁,共154頁，2024年2月25日，星期天一級(jí)結(jié)構(gòu)測定的基本策略與步驟（1）測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目（2）拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈（3）斷開多肽鏈內(nèi)的二硫橋（4）鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基（5）裂解多肽鏈成較小的片段（6）測定各肽段的氨基酸序列（7）分析每一多肽鏈的氨基酸組成（8）重建完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)（9）確定半胱氨酸殘基間形成的S-S交聯(lián)橋的位置第101頁,共154頁，2024年2月25日，星期天一級(jí)結(jié)構(gòu)測定的方法化學(xué)法（手工、自動(dòng)）水解法Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法肼解法、羧肽酶法質(zhì)譜法推定法第102頁,共154頁，2024年2月25日，星期天2．肽鏈選擇性地裂解并鑒定

上述測定多肽結(jié)構(gòu)順序的方法，對(duì)于分子量大的多肽是不適用的。對(duì)于大分子量多肽順序的測定，是將其多肽用不同的蛋白酶進(jìn)行部分水解，使之生成二肽、三肽等碎片，再用端基分析法分析個(gè)碎片的結(jié)構(gòu)，最后將各碎片在排列順序上比較并合并，即可推出多肽中氨基酸的順序。部分水解法常用的蛋白酶有：胰蛋白酶——只水解羰基屬于賴氨酸、精氨酸的肽鍵。糜蛋白酶——水解羰基屬于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的肽鍵。溴化氰———只能斷裂羰基屬于蛋氨酸的肽鍵。

第103頁,共154頁，2024年2月25日，星期天2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。Sanger法（二硝基氟苯（DNFB）法）3．測定N端和C端1）測定N端第104頁,共154頁，2024年2月25日，星期天F.Sanger及其他工作者花了約10年時(shí)間于1953年（35歲）首先測定出牛胰島素的氨基酸順序，由此Sanger獲得了1958年（41歲）的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。此后，有幾百種多肽和蛋白質(zhì)的氨基酸順序被測定出來，其中包括含333個(gè)氨基酸單位的甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶。以后F.Sanger又測定了DNA核苷酸順序，因而他第二次（1980年62歲）獲得了諾貝爾獎(jiǎng)（同美國人伯格、吉爾伯特共享）。兩次獲得諾貝爾獎(jiǎng)的化學(xué)家是很少見的，F(xiàn).Sanger是一個(gè)偉大的化學(xué)家。第105頁,共154頁，2024年2月25日，星期天②異硫氰酸酯法——艾德曼(Edman)降解法

測定咪唑衍生物的R，即可知是哪種氨基酸。特點(diǎn):除多肽N端的氨基酸外，其余多肽鏈會(huì)保留下來。這樣就可以繼續(xù)不斷的測定其N端。第106頁,共154頁，2024年2月25日，星期天③氨肽酶法氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)的向里水解。根基不同的反應(yīng)時(shí)間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。第107頁,共154頁，2024年2月25日，星期天2）測定C端（1）多肽與肼反應(yīng)(肼解法)

所有的肽鍵（酰胺）都與肼反應(yīng)而斷裂成酰肼，只有C端的氨基酸有游離的羧基，不會(huì)與肼反應(yīng)成酰肼。這就是說與肼反應(yīng)后仍具有游離羧基的氨基酸就是多肽C端的氨基酸。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。第108頁,共154頁，2024年2月25日，星期天（2）羧肽酶水解法在羧肽酶催化下，多肽鏈中只有C端的氨基酸能逐個(gè)斷裂下來。羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)的水解。根基不同的反應(yīng)時(shí)間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。2）測定C端第109頁,共154頁，2024年2月25日，星期天例：某八肽

完全水解后，經(jīng)分析氨基酸的組成為：丙、亮、賴、苯丙、脯、絲、酪、纈。端基分析：N-端丙……亮C-端。

胰蛋白酶催化水解：分離得到酪氨酸，一種三肽和一種四肽。

用Edman降解分別測定三肽、四肽的順序，結(jié)果為：丙-脯-苯丙；賴-絲-纈-亮。由上述信息得知，八肽的順序?yàn)椋旱?10頁,共154頁，2024年2月25日，星期天空間結(jié)構(gòu)測定的主要方法（1）X射線晶體技術(shù)（X-raycrystallography）（2）核磁共振波譜技術(shù)NMR(3)電子顯微技術(shù)ElectronMicroscopy（4）其他第111頁,共154頁，2024年2月25日，星期天二、X射線晶體結(jié)構(gòu)分析

概念：使用X射線作為物理工具，依賴X射線衍射現(xiàn)象為物理原理，以晶體作為研究對(duì)象，晶體結(jié)構(gòu)作為研究結(jié)果的一種分析方法。第112頁,共154頁，2024年2月25日，星期天X射線的產(chǎn)生條件

實(shí)驗(yàn)證明，高速運(yùn)動(dòng)著的電子突然被阻止時(shí)，伴隨著電子動(dòng)能的消失或轉(zhuǎn)化，會(huì)產(chǎn)生X射線。

⑴產(chǎn)生并發(fā)射自由電子的電子源，如加熱鎢絲發(fā)射熱電子；

⑵在真空中（一般為10-6mmHg），使電子作定向的高速運(yùn)動(dòng)；

⑶在高速電子流的運(yùn)動(dòng)路程上設(shè)置一障礙物（陽極靶），使高速運(yùn)動(dòng)的電子突然受阻而停止下來。第113頁,共154頁，2024年2月25日，星期天X射線晶體結(jié)構(gòu)測定樣本要求蛋白質(zhì)在溶液中處于過飽和狀態(tài)時(shí)分子間以規(guī)則的方式堆積——結(jié)晶分子間以無規(guī)則的方式堆積——沉淀正確錯(cuò)誤第114頁,共154頁，2024年2月25日，星期天5、衍射分析的基本理論（1）布拉格方程（衍射產(chǎn)生的條件）

nλ=2dsinθ

（2）周期函數(shù)和傅里葉定理

衍射強(qiáng)度與晶胞中原子的種類及分布的關(guān)系，并可互相轉(zhuǎn)換。

d——晶面間距；θ——掠射角或布拉格角（半衍射角）

λ——入射線波長2θ——衍射角

n——為整數(shù)，稱反射級(jí)數(shù)

第115頁,共154頁，2024年2月25日，星期天幾何理論的物理意義將入射線波長、衍射線方向以及光柵結(jié)構(gòu)三者建立起了數(shù)學(xué)的定量關(guān)系。為晶體結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ)。把光柵結(jié)構(gòu)（即晶體種晶胞的大小、形狀，包括對(duì)稱性）和衍射方向聯(lián)系起來。晶胞中原子分類及分布和電子密度圖聯(lián)系起來。第116頁,共154頁，2024年2月25日，星期天X射線晶體結(jié)構(gòu)測定優(yōu)點(diǎn)分辨率高無污染相對(duì)快捷能得到晶體完整性的大量信息

X射線晶體結(jié)構(gòu)測定缺點(diǎn)晶體構(gòu)象是靜態(tài)的，不能測定不穩(wěn)定的過渡態(tài)的構(gòu)象；很多蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大的單晶；（瓶頸）X射線晶體衍射的工作流程較長。第117頁,共154頁，2024年2月25日，星期天3、幾個(gè)概念晶體(crystal)

Thearrangementofatomsinthecrystalisperiodic.指離子、原子或分子這些微粒在三維空間中周期性重復(fù)排列形成的結(jié)構(gòu)。晶胞（UnitCell）Thesmallestcomponentofthecrystal,whichwhenstackedtogetherwithpuretranslationalrepetitionreproducesthewholecrystal.空間點(diǎn)陣的單位（大小和形狀完全相同的平行六面體），是晶體結(jié)構(gòu)的最小單位。第118頁,共154頁，2024年2月25日，星期天（4）晶體的初步鑒定第119頁,共154頁，2024年2月25日，星期天利用核磁共振現(xiàn)象獲取分子結(jié)構(gòu)、人體內(nèi)容結(jié)構(gòu)信息的波譜技術(shù)?！八拇竺V”：核磁共振譜、紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜核磁共振波譜法（nuclearmagneticresonance，NMR）第120頁,共154頁，2024年2月25日，星期天共振條件(1)核有自旋(磁性核)(2)外磁場,能級(jí)裂分;(3)照射頻率與外磁場的比值

0/H0=

/(2)——外加射場的頻率與原子核自旋進(jìn)動(dòng)的頻率相同第121頁,共154頁，2024年2月25日，星期天二、幾個(gè)重要波譜參數(shù)化學(xué)勢（位）移

在有機(jī)化合物中，各種氫核周圍的電子云密度不同（結(jié)構(gòu)中不同位置）共振頻率有差異，即引起共振吸收峰的位移，這種現(xiàn)象稱為化學(xué)位移。來源于核外電子云的磁屏蔽效應(yīng)大小與外加磁場強(qiáng)度成正比

化學(xué)勢移與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息是分析分子中各類氫原子所處位置的重要依據(jù)直接反映出蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息可以用于直接判斷氨基酸肽段的-螺旋、-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)第122頁,共154頁，2024年2月25日，星期天2.NOE信號(hào)強(qiáng)度當(dāng)分子內(nèi)有2個(gè)空間距離小于0.5nm的原子核時(shí)，如果用雙共振法照射其中一個(gè)核，使干擾場的強(qiáng)度增加到剛好使被干擾的譜線達(dá)到飽和，則另一個(gè)靠近的原子核的共振信號(hào)就會(huì)增加，這種現(xiàn)象稱核歐沃豪斯效應(yīng)（NOE)原因：空間位置靠近，交叉馳豫較強(qiáng)而導(dǎo)致核自旋之間的磁化強(qiáng)度轉(zhuǎn)移。該效應(yīng)的大小與原子之間距離的6次方成反比。NOE與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息是三維結(jié)構(gòu)的只要實(shí)驗(yàn)依據(jù)可以直接反映蛋白質(zhì)中質(zhì)子對(duì)間的距離2個(gè)質(zhì)子間越近，NOE信號(hào)強(qiáng)度越大有相鄰氨基酸殘基，短程，NOE強(qiáng)相隔1~4個(gè)氨基酸殘基，中程；以及相隔5個(gè)以上氨基酸殘基的遠(yuǎn)程，NOE弱二、幾個(gè)重要波譜參數(shù)第123頁,共154頁，2024年2月25日，星期天3.耦合常數(shù)J用以表征2核之間耦合作用的大小，單位赫茲Hz。耦合常數(shù)J與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息蛋白質(zhì)分子中異核間的單鍵J都具較大值在蛋白質(zhì)分子中，通過3個(gè)單鍵的核磁矩之間的遠(yuǎn)程J是反映主鏈與側(cè)鏈構(gòu)象的重要參數(shù)造成NMR譜圖中的信號(hào)峰形狀發(fā)生變化，通過解析這些峰形的變化，可以推測出分子結(jié)構(gòu)中各原子之間的連接關(guān)系。二、幾個(gè)重要波譜參數(shù)第124頁,共154頁，2024年2月25日，星期天4.馳豫時(shí)間原子核從激發(fā)狀態(tài)回復(fù)到平衡排列狀態(tài)的過程叫馳豫過程，其所需時(shí)間叫馳豫時(shí)間自旋晶格馳豫：又稱縱向馳豫（t1)，處于高能態(tài)的氫核把能量轉(zhuǎn)給周圍的分子（固體為晶格，液體則為周圍的液體分子或同類分子）變成熱運(yùn)動(dòng)而回到低能狀態(tài)。自旋-自旋馳豫：又稱橫向馳豫（t2)，2個(gè)進(jìn)動(dòng)頻率相同而取向不同的磁性核（能態(tài)不同的相同核），在一定距離內(nèi)相互交換能量，改變進(jìn)動(dòng)方向。馳豫時(shí)間與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息提供空間位阻、各向異性、分子大小、形狀等信息二、幾個(gè)重要波譜參數(shù)第125頁,共154頁，2024年2月25日，星期天5.譜峰面積峰面積與同類質(zhì)子數(shù)成正比，僅能確定各類質(zhì)子之間的相對(duì)比例。峰面積的積分值可作為定量分析的基礎(chǔ)譜圖中化合物的結(jié)構(gòu)信息（1）峰的數(shù)目：標(biāo)志分子中磁不等性質(zhì)子的種類，多少種；（2）峰的強(qiáng)度(面積)：每類質(zhì)子的數(shù)目(相對(duì))，多少個(gè)；（3）峰的位移(

)：每類質(zhì)子所處的化學(xué)環(huán)境，化合物中位置；（4）峰的裂分?jǐn)?shù)：相鄰碳原子上質(zhì)子數(shù)；（5）偶合常數(shù)(J)：確定化合物構(gòu)型。（二）幾個(gè)重要波譜參數(shù)第126頁,共154頁，2024年2月25日，星期天樣品要求高純度高濃度：核磁共振信號(hào)的強(qiáng)度與處于譜儀中“靈敏體積”內(nèi)的樣品的量成正比。穩(wěn)定分子量分子量的增大對(duì)核磁共振譜有兩方面的影響：(a)

譜的復(fù)雜程度會(huì)增加。(b)

每條譜峰的線寬也會(huì)增加。

NMR實(shí)驗(yàn)注意點(diǎn)第127頁,共154頁，2024年2月25日，星期天核磁共振技術(shù)優(yōu)點(diǎn)可以在溶液中操作，接近生理狀態(tài)同樣具有高分辨率分析并直接模擬出蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)與輔基和底物結(jié)合的情況以及酶催化的動(dòng)態(tài)機(jī)理核磁共振技術(shù)的不足樣品的分子量要比較?。?0KD以下）對(duì)不溶的蛋白比較困難（如膜蛋白）實(shí)驗(yàn)周期長（>1年）第128頁,共154頁，2024年2月25日，星期天電子晶體學(xué)單顆粒冷凍電鏡技術(shù)電子斷層成像術(shù)電子顯微技術(shù)

第129頁,共154頁，2024年2月25日，星期天1、電子晶體學(xué)首先必須得到在二維方向上高度有序且足夠大的蛋白質(zhì)二維晶體其三維重構(gòu)是通過傾轉(zhuǎn)樣品，拍攝不同角度下的電子衍射譜和電子顯微像，獲取不同轉(zhuǎn)角下的振幅好相位信息，在三維倒易空間中擬合，并加入相應(yīng)的晶體學(xué)對(duì)稱，通過逆傅里葉變換得到實(shí)空間的晶體結(jié)構(gòu)最大優(yōu)勢：得到的膜蛋白好膜相關(guān)的水溶性蛋白在膜環(huán)境中的結(jié)構(gòu)信息更反映生理狀態(tài)下的真實(shí)結(jié)構(gòu)。目前只能對(duì)二維晶體結(jié)構(gòu)的樣品達(dá)到原子或接近原子的分辨率水平第130頁,共154頁，2024年2月25日，星期天2、冷凍電鏡單粒子法是將樣品保存在液氮或液氮溫度下利用透射電子顯微鏡進(jìn)行二維成像，再經(jīng)過二維投射圖像的分析進(jìn)行三維重構(gòu)。優(yōu)點(diǎn)不用結(jié)晶高壓快速液氮冷凍包埋，減少了樣品在制備過程中的結(jié)構(gòu)破壞，接近生理狀態(tài)，同時(shí)也可減少電子束帶來的損傷場發(fā)射搶的使用提高了信噪比可捕捉不同概念狀態(tài)的瞬時(shí)構(gòu)象實(shí)時(shí)分辨（time-resolution)第131頁,共154頁，2024年2月25日，星期天3、電子斷層成像技術(shù)通過對(duì)每一樣品每間隔一定角度拍攝一副照片，得到幾十副（上百副）代表同一結(jié)構(gòu)不同角度下的二維投影像，然后對(duì)這一系列投影像對(duì)正，用加權(quán)背投影的方法獲得樣品的空間結(jié)構(gòu)。顯示的是完整結(jié)構(gòu)系統(tǒng)的靜態(tài)結(jié)構(gòu)信息面臨挑戰(zhàn)：冷凍含水技術(shù)、超薄切片技術(shù)、重復(fù)照射適用于細(xì)胞器、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、或巨大的超分子復(fù)合物在解決不具備周期性或全同性的生物大分子復(fù)合體系或細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)上具有優(yōu)勢第132頁,共154頁，2024年2月25日，星期天電子顯微技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1.可以直接獲得分子的形貌信息；2.適于解析那些不適合應(yīng)用X射線晶體學(xué)和核磁共振技術(shù)進(jìn)行分析的樣品（如難以結(jié)晶的膜蛋白，大分子復(fù)合體等）；3.適于捕捉動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化信息；4.易同其他技術(shù)相結(jié)合得到分子復(fù)合體的高分辨率的結(jié)構(gòu)信息；5.電鏡圖像中包含相位信息，所以在相位確定上要比X射線晶體學(xué)直接和方便。一種公認(rèn)的研究生物大分子、超分子復(fù)合體及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的有力手段。目前唯一能研究不同大小和結(jié)構(gòu)的方法。第133頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測的基本依據(jù)是： 每一段相鄰的氨基酸殘基具有形成一定二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測問題是模式分類問題二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測的目標(biāo)：判斷每一段中心的殘基是否處于

螺旋、

折疊、轉(zhuǎn)角（或其它狀態(tài)）之一的二級(jí)結(jié)構(gòu)態(tài)。

1、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測概述第134頁,共154頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）

研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)同基因組學(xué)一樣,蛋白質(zhì)組學(xué)不是一個(gè)封閉的、概念化的、穩(wěn)定的知識(shí)體系,而是一個(gè)領(lǐng)域。是基因組ＤＮＡ序列與基因功能之間的橋梁第135頁,共154頁，2024年2月25日，星期天第136頁,共154頁，2024年2月25日，星期天主要解決問題基本生物學(xué)問題Post-translationalmodificationProtein-proteininteract