綠色熒光蛋白GFP基因的克隆和表達(dá)

和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白;當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí),GFP發(fā)射綠色熒光;它產(chǎn)生熒光無需底物或輔因子發(fā)色團(tuán)是其蛋白質(zhì)一級(jí)序列固有的;GFP由3個(gè)外顯子組成,長(zhǎng)；GFP是由238個(gè)氨基酸所組成的單體蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量為短的垂直片段覆蓋,底部由一個(gè)短的垂直片段覆蓋,對(duì)熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于大空腔內(nèi);發(fā)色團(tuán)是和氧化形成.GFP樣結(jié)構(gòu),長(zhǎng)420nm,寬240nm,由11個(gè)圍折疊組成,熒光基團(tuán)的形成桶的頂部由3個(gè)短的垂直片直片段覆蓋,對(duì)熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于大空腔內(nèi);甚至測(cè)序;質(zhì)粒是一類在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的獨(dú)立于染色體外,能夠自主復(fù)制的穩(wěn)定的遺會(huì)可逆地整合到寄主染色體上,隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制,并通過細(xì)胞分裂傳遞到同的;有些質(zhì)粒復(fù)制受宿主細(xì)胞復(fù)制作用的嚴(yán)格限制,因此每個(gè)細(xì)胞中只含一個(gè)或幾個(gè)拷貝,稱為嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒,有的質(zhì)粒的復(fù)制受宿主細(xì)胞的控制不嚴(yán),稱為松弛型制,以至每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)可以增至一千到幾千;方法轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)菌時(shí),轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌會(huì)表現(xiàn)出質(zhì)粒基因所具有的新的生物表現(xiàn)型,例如,把一個(gè)含有抗藥基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌后,原來無抗藥性的細(xì)菌則表現(xiàn)出抗藥的新表型;借助轉(zhuǎn)化菌獲得的新表型特征,可證實(shí)質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入宿主細(xì)菌中,這樣就可以作為轉(zhuǎn)化菌的選擇性標(biāo)記;1、細(xì)菌的生長(zhǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增從瓊脂培養(yǎng)基平板上挑取一個(gè)單菌落,接種到含適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中養(yǎng)若干小時(shí),以便對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行選擇性擴(kuò)增;繞狀態(tài)而不能彼此分開;當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)如加入酸性的NaAc或Kac中和堿性于上清中;凝膠電泳中不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA,盡管分子量相同,但具有不同的電泳遷移三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑pEGFPNDHmLLB中;搖晃過夜;夜;培養(yǎng)箱,超凈臺(tái),恒溫?fù)u床,制冰機(jī),臺(tái)式離心機(jī),小型混合器,冰箱1.取DH5α培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,13000rpm離心1min;3.棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡;懸浮于100μL溶液Ⅰ中需劇烈振蕩,室溫下放置10min;5.加入新配制的溶液Ⅱ200μl,蓋緊管口,快速溫和顛倒eppendorf管5次,以混勻內(nèi)容物千萬不要振蕩,6.加入150μL預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口,并倒置離心管,溫和振蕩3次,使沉淀混勻,冰浴中15分rpm5min;7.上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的氯仿/異戊醇24：1,振蕩混勻,13000rpm離心2min;8.將水相移入干凈eppendorf管中,加入等體積的氯仿/異戊醇24：1振蕩混勻,13000rpm離心2min;9.將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后,置于室溫下2min,然后10.棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1mL70％乙醇洗沉淀一次,振蕩混勻rpmmin;11.吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,室溫干燥;12.將沉淀溶于30μLTE緩沖液,含20μg/mLRNaseA中,保存在-20℃冰箱中;質(zhì)粒DNA濃度的測(cè)定學(xué)習(xí)利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)算核酸的濃度和純度;實(shí)驗(yàn)材料與儀器pEGFP－N3和pET-28aDNA對(duì)照;4.按下sample,記錄260nm下DNA的濃度mg/ml;并同時(shí)記錄Dnmnm膠電泳瓊脂糖凝膠電泳的基本原理和操作方法;分子在凝膠基質(zhì)中遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)成反比;分子越大,遷移的越慢,因?yàn)槟Σ磷枇υ酱?也因?yàn)榇蠓肿油ㄟ^凝膠孔徑的效率低于較小的分子;2瓊DNA電泳遷移速率的對(duì)數(shù)和凝膠濃度之間存在線性相關(guān);3DNA的構(gòu)象超螺旋環(huán)如10×buffer,電導(dǎo)率升高,使得應(yīng)用適中的電壓也會(huì)產(chǎn)生大量的熱能,最嚴(yán)重時(shí)三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑冰箱,藍(lán)盾可見光透射儀成商業(yè)化酶的主要部分;大部分這類酶都以同二聚體的形式結(jié)合到DNA上,因而3333DNA化在兩條DNA鏈酶需要在一條DNA鏈的3’-末端具有一個(gè)游離的羥基OHDNA5’-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)-P;5335pEGFPNpETaDNA水浴鍋、移液器、電泳槽、電泳儀、振蕩器、制冰機(jī)、藍(lán)盾可見光透射儀、BamHI10U/μLTaKaRa公司;NotI10U/μLTaKaRa公司,T4ligase作步驟μL混合：PNpETaBamHINotI2222BSA液334.適當(dāng)放置冷卻,45℃左右倒于電泳膠板上,插好梳子;5.待凝膠凝固好以后,撥下梳子;6.酶切樣品中加入5μl溴酚藍(lán)-GeneFinder混合液混勻,上樣;7.1×TBEBuffer,80V3-4V/cm下電泳30min;NA加入加樣孔中3)跑膠,觀察結(jié)果,并且拍照;4)用干凈的刀片將需要的DNA條帶從凝膠上切下來,稱取重量;g00μL的體積加入PN;6)50℃水浴放置10min,期間不斷溫和上下翻動(dòng)離心管至膠完全融解;7)將上一步得到的溶液加入到一個(gè)吸附柱中,吸附柱再放入收集管,13000rpm離心60s,棄掉廢液;L漂洗液PW,13000rpm離心60s,棄掉廢液;L漂洗液PW,13000rpm離心60s,棄掉廢液;rpmmin;洗脫緩沖液先在65℃水浴預(yù)熱,室溫放置2min,13000rpm離心1min,然后將離心的溶液重新加;16℃連接過夜;512實(shí)驗(yàn)五大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的原理和方法;胞膜的透性發(fā)生改變,此時(shí)的細(xì)胞即呈現(xiàn)為感受態(tài);這一方法可以用于批量制備感胞可在-70℃凍存;轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒DNA的大腸桿菌隨后在培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)1hr,可使質(zhì)粒DNA中編碼抗生素抗性的基因得以表達(dá),因此,轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒DNA的大腸桿菌細(xì)胞可在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),而沒有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則無法生長(zhǎng);實(shí)驗(yàn)材料、儀器2.使用儀器液器、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、振蕩培養(yǎng)箱,制冰機(jī)管+1+2氨芐青管+1+22．感受態(tài)細(xì)胞的制備CaCl2法(1)挑一大腸桿菌單菌落放入3mlLB液體培養(yǎng)基含Kan+,37℃培養(yǎng)過夜;(2)活化大腸桿菌：取3ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基加入50-150μl的過夜菌,培養(yǎng)2-3個(gè)小時(shí);(3)將昨夜搖出來的DH5α或BL21培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10min,然后于4℃下4000rpm離心(4)棄去上清,用預(yù)冷的L的CaCl2溶液600μL輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置20min,4℃下4000rpm離心(5)棄去上清,加入300μL預(yù)冷的L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置5min,即成感受態(tài)細(xì)胞懸存;l上放置30min;s,熱激后迅速置于冰上冷卻5min;LLB液體培養(yǎng)基,混勻后在37℃振蕩培養(yǎng)30min;4從管1中取50μL涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,從管2中取50μL和100μL涂布于含抗生平板上;正面向上放置約10分鐘,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)20小時(shí);+管重組質(zhì)粒DNA是利用限制性內(nèi)切酶如BamHI和NotI分別酶切基因片段和質(zhì)粒再利用相同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別重組基因片段兩側(cè)的酶切位點(diǎn),通過酶切下的重ANA酶,脫氧核苷三磷酸底物和靶序列即模板等五部分組成,缺一不可;PCR技術(shù)能在試管中建立反應(yīng),經(jīng)數(shù)小時(shí)之后,就能將極微量的某一特定的目供了一種強(qiáng)有力的手段,對(duì)整個(gè)生命科學(xué)的研究與發(fā)展都有深遠(yuǎn)的影響;因此,PCR技術(shù)產(chǎn)生的時(shí)間雖不長(zhǎng),卻以驚人的速度廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域;它可用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析、突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因多態(tài)性的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機(jī)制的探索及法醫(yī)鑒定等諸多方面;三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑PCR儀,掌中寶離心機(jī),冰箱,小型混合器,電泳槽和電泳儀,離心管,移液器及吸箱1.雙酶切法(1)隨機(jī)挑取2個(gè)單菌落,接種,37℃振蕩培養(yǎng)過夜;(2)質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法;(3)雙酶切鑒定體系10μl;BamHIXhoI221166(4)室溫酶切;(5)配制%M/V普通瓊脂糖凝膠20ml;(6)酶切樣品中加入5μl溴酚藍(lán)-GeneFinder混合液混勻,上樣;(7)1×TBEBuffer,80V3-4V/cm下電泳30min;(8)熒光激發(fā)器觀察質(zhì)粒DNA條帶的酶切情況,并照像;并確定最終的陽性克隆2.菌落PCR法(1)挑取菌落隨機(jī)挑取5個(gè)菌落;首先使用無菌槍頭挑取菌落,在已準(zhǔn)備好的含有卡那抗菌素,分好區(qū)的固為保菌種,然后將余下菌置于eppendorf管中作為PCR反應(yīng)模板;(2)PCR反應(yīng)體系20μl95℃反應(yīng)物體積/5min予變性cles72℃左引物10min延伸(4)PCR產(chǎn)物的右引物檢測(cè)PCR產(chǎn)物加入Taq酶5U/μL編號(hào)加入DNA瓊脂MgCl225mM5μl溴酚藍(lán)-GeneFinder混合液,分別按糖凝膠電泳的加樣孔,使用1%瓊脂糖電泳分離;10×Buffer2(5)用熒光激ddH2O發(fā)器看結(jié)果,確定陽性克隆的位置;GFP白的誘導(dǎo)表達(dá)IPTGGFP及基本操作步驟;IPTG異丙基硫代β-L半乳糖苷是一種常見的誘導(dǎo)基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑,結(jié)構(gòu)類似乳糖;結(jié)合到這些順式作用元件的蛋白因子的控制;LacI基因編碼調(diào)節(jié)蛋白,可以四聚體的形式結(jié)合到操縱OBLTRNAT7啟動(dòng)子位點(diǎn),從而啟動(dòng)GFP基因的表達(dá);實(shí)驗(yàn)材料和儀器BLpET28a重組質(zhì)粒DNA離心機(jī),冰箱,小型混合器,移液器,恒溫培養(yǎng)箱,手持式紫外燈,超凈工作臺(tái);1.取陽性克隆質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化BL21；2.在含有Kan＋的固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)20h；℃振蕩培養(yǎng)過夜；4.取4支無菌帶蓋試管,加入新鮮LB液體培養(yǎng)基含有Kan＋5ml,按1：20稀釋比例加入過夜菌,37℃3小時(shí);5.加入IPTG1：1000至終濃度1mmol/L,分別誘導(dǎo)0h,1h,2h,4h;6.分別取,10000rpm離心5min,去除上清,收集沉淀,再重復(fù)一次收集沉淀;7.分別取IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)液20μl涂布在含Kan＋的固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)20小時(shí);8.觀察蛋白表達(dá)用紫外線照射菌體沉淀及培養(yǎng)平板,可以看到綠色熒光;分別對(duì)均勻涂布的平板以及表達(dá)蛋白的樣品管照相,保存照片;(1)學(xué)習(xí)從兔肝中提取RNA的原理和方法;(2)通過紫外吸收法測(cè)定RNA的含量;(3)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性;從水相中沉淀,達(dá)到分離;胍或有機(jī)溶劑苯酚/氯仿等來解決;異硫氰酸根和胍離子都是很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑,潔,盡量減少空氣流動(dòng),如條件允許,可在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行;五、實(shí)驗(yàn)中RNA酶最有關(guān)的操作時(shí),都應(yīng)戴一次性手套,接觸不干凈的玻璃器皿和物品以后,手套就可驗(yàn)材料、儀器及試劑gmin內(nèi)速冷凍保存于液氮或-70℃冰箱待用;mlLDEPC有①2mol/L乙酸鈉,②100g/LSLSmolLSodiumCitrate檸檬酸鈉,④CSB液42mmol/Lml解,加入8-羥基喹啉至終濃度為1g/L溶解混勻,此時(shí)溶液mmolL的乙酸鈉抽提,重復(fù)數(shù)次,直至上層水相pH大于;作步驟①取0.2g組織,置入預(yù)冷的組織勻漿器中,在冰浴中勻漿,充分研碎組織;②加入變性液D,冰上勻漿至液體粘稠,無小組織塊;lsec放置in⑧4℃離心,取上層水相,加等體積預(yù)冷異丙醇,-20℃放置20min~30min;⑩用20μlDEPC處理過的水溶解沉淀,取少量鑒定;RNA量的鑒定RNA用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)波長(zhǎng)230nm、260nm、280nmODRNAgLOD計(jì)算ODODOD0/OD280的比值以估測(cè)RNA的純度;RNA完整性的鑒定1)配制%M/V普通瓊脂糖凝膠;2)適當(dāng)放置冷卻,45℃左右倒于電泳膠板上,插好梳子;3)待凝膠凝固好以后,撥下梳子;4)取10μlRNA樣品,3μl的genefinder染色,混勻,上樣;5)1×TBEBuffer,60V3-4V/cm下電泳30min;6)紫外燈下觀察RNA條帶的分離情況,并照像;2)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)帶手套,實(shí)驗(yàn)的儀器