高三生物一輪復(fù)習(xí)課件第41講基因工程

第41講

基因工程主要考點(diǎn)

必備知識考點(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序考點(diǎn)三實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定考點(diǎn)四基因工程的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程考點(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具

基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。1．基因工程的概念別名重組DNA技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作環(huán)境操作對象操作水平結(jié)果原理特點(diǎn)主要在生物體外基因（DNA）DNA分子水平創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品基因重組定向改造生物遺傳特性；徹底打破種間界限一、基因工程這種技術(shù)是在生物體外，通過對DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。2.不同種生物的基因能“拼接”的理論基礎(chǔ)：①DNA都是由4種脫氧核苷酸組成3.目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)原因：地球上所有的生物共用一套密碼子。遺傳信息的傳遞都遵循中心法則②雙鏈DNA空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)4.基因重組還有哪些類型？減數(shù)分裂I前期，同源染色體上非姐妹染色單體間的互換；減數(shù)分裂I后期，非同源染色體上非等位基因的自由組合。一、基因工程1.限制性內(nèi)切核酸酶（內(nèi)切酶）——“分子手術(shù)刀”

切割DNA分子的工具①來源：主要是從原核生物中分離純化出來的一類酶。②種類：數(shù)千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）二、基因工程的工具③作用：識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。*確切來說應(yīng)該是催化磷酸二酯鍵斷開*該過程“特定”體現(xiàn)了酶的專一性*限制酶只切割兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。即一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。④識別序列

大多數(shù)限制酶的識別序列由___個(gè)核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由___個(gè)、___個(gè)或__________的核苷酸組成。648其他數(shù)量EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’*限制酶所識別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。二、基因工程的工具⑤切割結(jié)果DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式——________和_______黏性末端平末端當(dāng)限制酶在它的識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端當(dāng)限制酶在它的識別序列的中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的是平末端二、基因工程的工具*EcoRⅠ識別序列為GAATTC*EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端*形成的黏性末端（從5’往3’讀）為__________*一個(gè)限制酶切割一次形成_______個(gè)黏性末端*同一種限制酶切割形成的黏性末端_________*兩個(gè)黏性末端有__________個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。AATT-兩相同2二、基因工程的工具現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________GATC-AATT-AGCT-GATC-思考：你從中發(fā)現(xiàn)什么現(xiàn)象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端二、基因工程的工具現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：以下黏性末端是由__種限制酶作用產(chǎn)生的3思考：你從中發(fā)現(xiàn)什么現(xiàn)象了？相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的二、基因工程的工具種類E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶來源作用相同點(diǎn)大腸桿菌T4噬菌體只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對較低）恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵2.DNA連接酶——“分子縫合針”①.DNA連接酶作用：②.基因工程常用的DNA連接酶有兩種：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，二、基因工程的工具兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！E·coliDNA連接酶的縫合作用二、基因工程的工具③.DNA連接酶、DNA聚合酶、限制酶、解旋酶的比較種類作用作用部位DNA連接酶DNA聚合酶限制酶DNA酶解旋酶連接兩個(gè)DNA片段形成磷酸二酯鍵將單個(gè)的脫氧核苷酸連接的已有的核苷酸鏈上形成磷酸二酯鍵①識別特定脫氧核苷酸序列②有特定的切割位點(diǎn)破壞磷酸二酯鍵催化DNA水解為脫氧核苷酸破壞磷酸二酯鍵解開DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞氫鍵二、基因工程的工具①作用：作為運(yùn)輸工具，攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞中3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”③最常用的載體——質(zhì)粒:（1）本質(zhì)：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子

。（真核生物酵母菌細(xì)胞）二、基因工程的工具②種類：質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒（2）質(zhì)粒作為載體需具備的條件（2）有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，以便插入（攜帶）目的基因。（可攜帶多個(gè)或多種外源基因）（3）具有某些標(biāo)記基因，以便鑒定和篩選出含目的基因的受體細(xì)胞。（4）對宿主細(xì)胞無害。標(biāo)記基因的篩選原理：

一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒有抵抗該抗生素的能力。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞。二、基因工程的工具基因工程的工具限制酶①主要存在于原核生物中②具有專一性(識別序列)③切開DNA分子的磷酸二酯鍵④產(chǎn)生黏末端或平末端DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒載體具備的條件①能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制②并穩(wěn)定存在③具一種至多種限制酶切點(diǎn)④具標(biāo)記基因小結(jié)考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子【培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程】1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測與鑒定

基因工程的一般操作程序主要包括四個(gè)步驟：目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測與鑒定。（核心步驟）1.目的基因（1）概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物

等的基因。（2）作用:根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要指編碼蛋白質(zhì)的基因。一、目的基因的篩選與獲取從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一2.篩選合適的目的基因3.獲取目的基因的方法⑵從_________中獲取從____________中獲取從部分基因文庫(如cDNA文庫)中獲取基因文庫基因組文庫⑴用_____方法直接人工合成條件：基因比較小，

已知方法：通過___________用化學(xué)方法直接

人工合成化學(xué)核苷酸序列DNA合成儀⑶利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

概念：PCR是________________的縮寫，它是一項(xiàng)根據(jù)________________的原理，在體外提供______________的各種組分與反應(yīng)條件，對_____________________進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制參與DNA復(fù)制目的基因的核苷酸序列①一、目的基因的篩選與獲取3.獲取目的基因的方法⑶利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR擴(kuò)增儀②PCR的條件：

目的基因DNA(模板)、四種游離的脫氧核苷酸、耐高溫DNA聚合酶、引物、一定的緩沖溶液(維持反應(yīng)體系的pH）、Mg2+（激活DNA聚合酶的活性）

控制溫度變化引物是一小段能與________的一段堿基序列________的___________。用于PCR的引物有

種，長度通常為20~30個(gè)核苷酸。DNA母鏈互補(bǔ)配對短單鏈核酸2

前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列設(shè)計(jì)引物3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2引物結(jié)合在模板鏈的3’端一、目的基因的篩選與獲取⑶利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3′5′子鏈的延伸方向是5′→3′？DNA聚合酶3′5′模板鏈子鏈因?yàn)镈NA聚合酶不能直接將單個(gè)的核苷酸聚合成鏈DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有鏈的3′-端子鏈合成需要引物？一、目的基因的篩選與獲取⑶利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3’5’3’5’3’5’3’5’①變性

當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈②復(fù)性當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合③延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’一、目的基因的篩選與獲?、抢肞CR技術(shù)擴(kuò)增目的基因③過程：1）變性：當(dāng)溫度上升到_______以上時(shí)，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

氫鍵單鏈DNA90℃變性的溫度為何是90℃以上的一個(gè)溫度范圍，而不是95℃？因?yàn)樽冃缘臏囟扰c氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時(shí)，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時(shí)，所需溫度也就越低。2）復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過

與兩條單鏈DNA結(jié)合。

堿基互補(bǔ)配對3）延伸：當(dāng)溫度上升到______左右時(shí)，溶液中的4種____________在耐高溫的____________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。

脫氧核苷酸DNA聚合酶72℃為什么溫度要上升至72℃？Taq酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？

72℃是Taq酶的最適溫度Taq酶結(jié)合在引物的3’端一、目的基因的篩選與獲取第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物3’5’3’5’3’5’3’5’第一輪循環(huán)的產(chǎn)物3’5’3’5’④PCR擴(kuò)增過程中引物、原料需要源源不斷的加入。

由于一個(gè)循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。

即成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。一、目的基因的篩選與獲取5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’思考獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能分離出目的基因？至少要三次循環(huán)。第一輪產(chǎn)生的子鏈長度小于模板鏈長度，到第三輪循環(huán)時(shí)，才出現(xiàn)2個(gè)兩條脫氧核苷酸鏈等于目的基因。一、目的基因的篩選與獲取復(fù)性的過程一定是引物與DNA模板鏈結(jié)合嗎？

復(fù)性時(shí)引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在解開的兩條DNA單鏈的結(jié)合，但兩條模板鏈重新結(jié)合的概率較低，原因是：①模板鏈一般比較長，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數(shù)量少，引物與模板之問的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會(huì)。思考一、目的基因的篩選與獲取【補(bǔ)充】基因的結(jié)構(gòu)DNA片段基因1基因2基因3放大基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段能編碼特定的蛋白質(zhì)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子連續(xù)的、不間隔的非編碼區(qū)：含有能調(diào)控遺傳信息表達(dá)的DNA序列不轉(zhuǎn)錄，不編碼蛋白質(zhì)RNA聚合酶識別并結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA啟動(dòng)子終止子本質(zhì)：位置：作用：是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；位于基因上游；本質(zhì)：位置：作用：也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；位于基因下游；終止轉(zhuǎn)錄真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游間隔的、不連續(xù)的外顯子：內(nèi)含子：數(shù)量關(guān)系：外顯子=內(nèi)含子+1能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列轉(zhuǎn)錄初級RNA成熟mRNA非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345啟動(dòng)子終止子【思考】真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？剪切、拼接DNA聚合酶單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子【總結(jié)】原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是

的編碼區(qū)是間隔的、

的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的

和具有調(diào)控作用的

區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的：2.基因表達(dá)載體的組成思考：要各個(gè)元件有什么作用？（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。01目的基因的篩選與獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心步驟目的基因：編碼蛋白質(zhì)的基因或具有調(diào)控作用的因子。啟動(dòng)子：本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)終止子：本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄四環(huán)素抗性基因、熒光蛋白基因等標(biāo)記基因：作用為鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心步驟載體≠表達(dá)載體：1.二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。2.表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子【區(qū)分兩組概念】特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位于mRNA上翻譯的起始點(diǎn)翻譯的終點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的終點(diǎn)本身不轉(zhuǎn)錄決定氨基酸不決定氨基酸二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心步驟基因表達(dá)載體3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心步驟①首先用一定的

切割載體（質(zhì)粒），使它出現(xiàn)一個(gè)切口。②然后用

限制酶或能產(chǎn)生

末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③再利用

將含目的基因的DNA片段拼接到

的切口處，這樣就形成了一個(gè)重組DNA分子（基因表達(dá)載體）。限制酶同種相同DNA連接酶載體載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種培育抗蟲棉的簡要過程使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，共有幾種連接情況？問題探討載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1如何解決這一問題？

選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對目的基因和質(zhì)粒切割，防止目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心步驟（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因?yàn)镾maⅠ切割會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。若被破壞，無法進(jìn)一步篩選。思考：構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中，如何避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（保證目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接）？二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心步驟（2）只使用EcoRⅠ分別切割質(zhì)粒和外源DNA，能否構(gòu)建基因表達(dá)載體？如果能，有何弊端？能①質(zhì)粒、目的基因會(huì)發(fā)生自身環(huán)化連接；②會(huì)發(fā)生兩兩自身連接；③質(zhì)粒與目的基因會(huì)發(fā)生反向連接。思考：構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中，如何避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（保證目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接）？二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心步驟（3）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。思考：構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中，如何避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（保證目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接）？二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心步驟（1）不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SamⅠ（2）保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心步驟（3）確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（或?yàn)榱吮ＷC目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接），可選用什么限制酶？可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒。（4）保證目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)（常用）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞②在植物授粉后一定時(shí)間內(nèi)，剪去

，將DNA溶液滴在

，使目的基因通過

進(jìn)入

。①用微量注射器將

溶液直接注入

中；花粉管通道法導(dǎo)入外源DNA（1）花粉管通道法（我國獨(dú)創(chuàng)）1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞含目的基因DNA子房柱頭花柱切面花粉管通道胚囊①轉(zhuǎn)化：指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞②原理：

農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有

，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的

轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的

上。Ti質(zhì)粒T-DNA染色體DNA可轉(zhuǎn)移的DNA三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞46目的基因Ti質(zhì)粒表達(dá)載體農(nóng)桿菌植物細(xì)胞植物細(xì)胞染色體DNA新性狀植株構(gòu)建轉(zhuǎn)入導(dǎo)入插入表達(dá)③過程：（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法目的基因插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA中重組DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌侵入植物將目的基因帶入植物細(xì)胞含外源目的基因的重組DNA整合到植物細(xì)胞的基因組中目的基因遺傳特性穩(wěn)定維持和表達(dá)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞該過程經(jīng)過____次拼接、____次導(dǎo)入①第一次拼接：_______________________________②第二次拼接：

______________________________________________________________③第一次導(dǎo)入：__________________________________④第二次導(dǎo)入：__________________________________將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌將插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌將含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（非人工操作）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）導(dǎo)入方法：（2）受體細(xì)胞:顯微注射法受精卵為什么常選用受精卵作為受體細(xì)胞呢？①體積大，易操作。②易表現(xiàn)出全能性。（3）過程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（移植到同期發(fā)情的母畜子宮內(nèi)）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）常用方法：Ca2+處理原核細(xì)胞（常選擇大腸桿菌）（2）受體細(xì)胞：Ca2+感受態(tài)細(xì)胞吸收3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞使用Ca2+處理：增加細(xì)胞壁的通透性，可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（感受態(tài)細(xì)胞）。Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子【注意】原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。（因?yàn)闆]有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體對蛋白質(zhì)進(jìn)一步加工。）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法種類項(xiàng)目植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法

受體細(xì)胞

轉(zhuǎn)化過程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA中→表達(dá)目的基因表達(dá)載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細(xì)胞→重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2＋處理法體細(xì)胞或受精卵受精卵原核細(xì)胞

在抗蟲棉的培育過程中，目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道Bt基因mRNABt抗蟲蛋白抗蟲棉PCR等技術(shù)檢測抗原—抗體雜交技術(shù)分子水平抗蟲鑒定（個(gè)體水平）四、目的基因的檢測與鑒定PCR技術(shù)PCR技術(shù)抗原—抗體雜交雜交帶檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。四、目的基因的檢測與鑒定考點(diǎn)三

實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)。（分離提取DNA）DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。（溶解提純DNA）1.實(shí)驗(yàn)原理（2）鑒定原理（1）提取原理在一定溫度下（在沸水浴條件下），DNA遇二苯胺，會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色。一、DNA的粗提取與鑒定DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。注意：不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。（1）選材：（2）試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——析出DNA——溶解DNA2.材料用具——破壞細(xì)胞，釋放出細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，維持DNA穩(wěn)定，提高DNA溶解度——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用,用棕色瓶保存。鑒定時(shí)需沸水浴加熱5分鐘，溶液的藍(lán)色的深淺與溶液中DNA含量的多少相關(guān)?！稳隢aCl溶液中，使?jié)舛认陆抵?.14mol/L，析出DNA一、DNA的粗提取與鑒定（1）研磨洋蔥

稱取約30g洋蔥切碎，放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。（2）過濾獲取含DNA的上清液

方法一：在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，取上清液。

方法二：直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液。3.方法步驟思考：過濾能否用濾紙代替紗布？不可以，因?yàn)镈NA會(huì)被吸附到濾紙上而大量損失，最終影響提取的DNA量。一、DNA的粗提取與鑒定（3）析出DNA方法一：在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌（避免破壞DNA），卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；加入預(yù)冷酒精一、DNA的粗提取與鑒定3.方法步驟（3）析出DNA方法二：將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。離心棄上清液一、DNA的粗提取與鑒定3.方法步驟（4）DNA的鑒定試管編號對照組實(shí)驗(yàn)組步驟12mol/L的NaCl溶液2mol/L的NaCl溶液步驟2不進(jìn)行任何處理加絲狀物或沉淀步驟3加4mL二苯胺，混勻加4mL二苯胺，混勻步驟4沸水浴5min沸水浴5min實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象溶液不變藍(lán)色溶液逐漸變成藍(lán)色實(shí)驗(yàn)結(jié)論DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色一、DNA的粗提取與鑒定3.方法步驟取上清液充分研磨紗布過濾95%冷酒精離心離心絲狀物沉淀物(1)以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止

。血液凝固(2)利用動(dòng)物細(xì)胞提取DNA時(shí)動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，可使其

。(3)不能選用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞

。無細(xì)胞核吸水漲破4.操作提示一、DNA的粗提取與鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理（1）原理①PCR利用了DNA的______原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺能夠_____________的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷___次循環(huán)；熱變性調(diào)節(jié)溫度自動(dòng)調(diào)控溫度30②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制的原理；二、DNA片段的擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL總體積50μL注：模板DNA的用量為1gp～1μg①加液：用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分2.方法步驟二、DNA片段的擴(kuò)增②離心：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）③反應(yīng)：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。2.方法步驟二、DNA片段的擴(kuò)增1.原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在_____的作用下，這些_______會(huì)向著________________的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是_____。可解離的基團(tuán)pH電場帶電分子電泳與它所帶電荷相反②PCR的產(chǎn)物一般通過_______________來鑒定瓊脂糖凝膠電泳④凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為______的______下被檢測出來。染色300nm紫外燈③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、______________和_____等有關(guān)。凝膠的濃度DNA分子的大小構(gòu)象三、DNA片段的電泳鑒定①配制瓊脂糖溶液

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻②制備凝膠A.將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。C.將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜B.待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。三、DNA片段的電泳鑒定2.方法步驟③加樣

：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物④電泳：

接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳⑤觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相三、DNA片段的電泳鑒定2.方法步驟注意:①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。

②該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。

③在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。④在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。

⑤PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。三、DNA片段的電泳鑒定3.結(jié)果分析與評價(jià)(1)你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？(2)你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶，該片段大小約為750bp。

如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。三、DNA片段的電泳鑒定考點(diǎn)四基因工程的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程1.基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用抗蟲功能的基因抗病基因降解或抵抗一、基因工程的應(yīng)用蛋白質(zhì)編碼基因花青素代謝相關(guān)的基因外源生長激素基因乳糖酶基因乳汁1.基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用一、基因工程的應(yīng)用2.基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用基因改造顯微注射抗原決定基因克隆免疫排斥一、基因工程的應(yīng)用工程菌牛凝乳酶的基因基因工程菌3.基因工程在食品工業(yè)方面的應(yīng)用一、基因工程的應(yīng)用基因工程外源基因高效表達(dá)基因工程構(gòu)建基因工程菌工業(yè)發(fā)酵批量生產(chǎn)1概念：2步驟：3應(yīng)用：用_________的方法，使_________得到__________的菌類，一般稱為基因工程菌利用基因工程菌，除了可以生產(chǎn)藥物，還能生產(chǎn)食品工業(yè)用酶、氨基酸和維生素等基因工程菌一、基因工程的應(yīng)用蛋白質(zhì)工程