1.2.2微生物的選擇培養(yǎng)與計數(shù)課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修32

第2節(jié)

微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用——微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)(第1課時)第1章發(fā)酵工程

自然界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合菌群中不是優(yōu)勢種群時，更難實現(xiàn)，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實現(xiàn)。該怎么辦？

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是一種在體外擴增DNA片段的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫的DNA聚合酶。1973年，科學(xué)家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌，進而提取出耐高溫的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）討論：1.篩選水生棲熱菌的思路是什么樣的？根據(jù)微生物對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找耐高溫的酶耐高溫生物體高溫環(huán)境（熱泉、火山口）尋找尋找2.為什么水生棲熱菌能從熱泉中篩選出來呢？

這是因為水生棲熱菌能在70-80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：1.在被石油污染的土壤中可以篩選________微生物2.在冰川凍土層可以篩選______微生物3.漆酶屬于木質(zhì)降解酶類，分離產(chǎn)漆酶菌株的首選樣品是生活污水嗎？___________

由以上例子可知，某些微生物適應(yīng)某些特定的環(huán)境條件，而絕大多數(shù)微生物在這種條件下不能生存，因此可以通過這個原理從環(huán)境中獲得某種特定種類的微生物。

實驗室中微生物的篩選，可以應(yīng)用這個原理嗎？石油分解耐寒不是一、選擇培養(yǎng)基1.原理：

人為提供

_________________的條件（包括_____、_____和_____等），同時___________________________。有利于目的菌生長抑制或阻止其他微生物的生長營養(yǎng)溫度pH2.概念：

在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基稱為選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基應(yīng)該如何進行配置？3.舉例：（1）利用改變培養(yǎng)條件進行選擇培養(yǎng)。70～80℃的高溫分離耐高溫的水生棲熱菌使用將pH調(diào)至酸性的培養(yǎng)基分離耐酸菌（2）利用營養(yǎng)條件進行選擇培養(yǎng)不加有機碳源的培養(yǎng)基分離出自養(yǎng)型微生物不加有機氮源的培養(yǎng)基分離出固氮菌（3）利用添加某種化學(xué)物質(zhì)進行選擇培養(yǎng)加入青霉素分離酵母菌、霉菌等真菌思考·討論選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細菌分解成NH3，再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶，脲酶催化尿素分解產(chǎn)生NH3，NH3可以作為細菌生長的氮源。討論：1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養(yǎng)基的配方該如何設(shè)計？

在選擇培養(yǎng)基中，以尿素作為唯一氮源，只有能合成脲酶的細菌才能生長發(fā)育繁殖2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點和不同點？

除以尿素作為唯一氮源外，該培養(yǎng)基的其他營養(yǎng)成分與普通培養(yǎng)基基本相同思考：怎么證明一個選擇培養(yǎng)基具有選擇性呢？

應(yīng)該設(shè)置基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）或完全培養(yǎng)基作為對照，若基礎(chǔ)培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基中生長的菌落數(shù)菌多于該選擇培養(yǎng)基，則該選擇培養(yǎng)基具有選擇性；及時練：選擇培養(yǎng)基可以從混雜的微生物群體中分離出所需的微生物，通過不加碳源的培養(yǎng)基、不加氮源的培養(yǎng)基、以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基，可從土壤中分離出的微生物依次是（）A.硝化細菌、放線菌、根瘤菌B.根瘤菌、青霉菌、固氮菌C.異養(yǎng)型細菌、放線菌、硝化細菌D.自養(yǎng)型細菌、固氮菌、分解尿素的細菌D1.方法

可采用_____________；2.方法概述由于土壤細菌的數(shù)量龐大，要想得到特定微生物的純培養(yǎng)物，必須要對土壤進行________，然后再將菌液_____到制備好的__________上；

兩個基本操作：________和________稀釋涂布平板法充分稀釋涂布選擇培養(yǎng)基梯度稀釋涂布平板二、微生物的選擇培養(yǎng)①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。1ⅹ1090mL無菌水1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1041mL1mL1mL1mL9mL無菌水1mL②取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。3.操作過程：（1）梯度稀釋1mL思考：此時稀釋了多少倍10倍(計算時，不要忽略)（2）涂布平板③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，培養(yǎng)。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。注意：將涂布器從酒精中取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，再放在火焰上灼燒；不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。

待涂布的菌液被

__________后，將平板_____，放入___________中培養(yǎng)

____d，在涂布有________菌液的平板上就可以觀察到分離的_______；培養(yǎng)基吸收倒置恒溫培養(yǎng)箱1-2合適濃度單菌落（3）培養(yǎng)注意：由于使用的是選擇培養(yǎng)基，所以一般情況下，獲得的單菌落即目的菌，但因為有些微生物可以利用目的菌的代謝產(chǎn)物來生長繁殖，所以還需要進一步驗證；注：(1)涂布平板的所有操作均在酒精燈火焰旁進行。(2)不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中,以免引燃酒精。(3)在用移液管吸取菌液進行梯度稀釋時,要使菌液與水充分混勻。實驗設(shè)計方法分析(1)設(shè)立重復(fù)組:在同一稀釋度下,要至少涂布3個平板作為重復(fù)組,以增強實驗結(jié)果的說服力與準確性。(2)設(shè)立兩種對照組①判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染,需同時將未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和未接種的選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。②判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用,需同時設(shè)置已接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行培養(yǎng),觀察兩種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目,進行對比得出結(jié)論。及時練：某小組同學(xué)為了調(diào)查湖水中細菌的污染情況而進行了實驗，包括制備培養(yǎng)基、滅菌、接種及培養(yǎng)、菌落觀察與計數(shù)。下列與此實驗相關(guān)問題的敘述，正確的是（）A.實驗用過的帶菌培養(yǎng)基經(jīng)過加熱后才能倒掉B.只可利用平板劃線法對細菌進行分離純化并計數(shù)C.培養(yǎng)基中含有的蛋白陳主要為細菌培養(yǎng)提供氮源和維生素等D.觀察細菌培養(yǎng)的實驗時，最好是在另一平板上接種無菌水作為對照進行實驗

D三、微生物的數(shù)量測定（一）稀釋涂布平板法——間接計數(shù)法高單菌落樣品稀釋液活菌活菌菌落

稀釋涂布平板法除可以分離微生物外，也常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目；當樣品的稀釋度足夠___時，培養(yǎng)基表面生長的一個____，來源于__________中的一個____；通過計數(shù)平板上的____數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少_____；

1.原理樣品的稀釋度將直接影響平板上的菌落數(shù)目稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照2.計數(shù)原則（1）選擇菌落數(shù)為_______的平板計數(shù)；（2）____稀釋度下，應(yīng)____對___個平板進行重復(fù)計數(shù)，然后求出______；3.結(jié)果分析（1）統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目____；原因：______________________________________________________________________（2）統(tǒng)計結(jié)果一般用_______而不是用活菌數(shù)來表示；30-300同一至少3平均值少當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落菌落數(shù)（3）計算C代表某一稀釋度下平板上生長菌落數(shù)的平均值；V代表涂布平板時吸取的稀釋液體積數(shù)值(mL)；M代表稀釋倍數(shù)；則每克樣品中的細菌數(shù)=__________（C÷V）×M現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每g樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109C.234

D.23.4B及時練：1.統(tǒng)計菌落數(shù)目時，統(tǒng)計的菌落數(shù)就是活菌的實際數(shù)目（）2.統(tǒng)計菌落數(shù)目的理論依據(jù)是一個菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌（）

??（1）方法：利用特定的

___________或

_____________在

______下觀察、計數(shù)，然后再計算

_________的樣品中微生物的數(shù)量；細菌計數(shù)板血細胞計數(shù)板顯微鏡一定體積血細胞計數(shù)板常用于

_______________________________等的計數(shù)相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子細菌計數(shù)板可對

_________________進行觀察和計數(shù)；細菌等較小的細胞（一）顯微鏡直接計數(shù)法——直接計數(shù)法（2）優(yōu)點：快速直觀（3）缺點：①統(tǒng)計的結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和，不能區(qū)分死菌與活菌。②個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。計數(shù)一個小方格內(nèi)酵母菌數(shù)量，再以此為依據(jù)估計培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)。1mL培養(yǎng)液中細胞個數(shù)＝X1mL=0.1mm3(10-4mL)每小方格中細胞的個數(shù)×400四、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)四、探究實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)1.提出問題（實驗?zāi)康模?）從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌。（2）統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌。2.實驗原理

絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出_________的細菌。脲酶以尿素作為唯一氮源選擇分解尿素CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO23.實驗步驟（1）土壤取樣①取樣地點要求：

酸堿度接近中性的潮濕土壤。細菌適宜在該環(huán)境中生長。②取樣過程：

鏟去表層土（一般3cm左右）。細菌絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。③注意事項：

取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。（2）制備培養(yǎng)基①選擇培養(yǎng)基：以尿素為唯一氮源②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：作為對照組，來判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml（3）樣品的稀釋與涂布平板（稀釋涂布平板法）

測細菌時，一般選用104、105、106倍稀釋的稀釋液進行平板培養(yǎng)

在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，應(yīng)選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。①每個濃度至少設(shè)置4個平板，1、2、3平板是選擇培養(yǎng)基（實驗組，三個重復(fù)），4為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基②如何驗證培養(yǎng)基中是否含有雜菌？設(shè)置2個平板作為對照：不涂布稀釋液的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基注意事項：

本實驗使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標記。例如，在標記培養(yǎng)皿時應(yīng)該注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。（4）微生物的培養(yǎng)與觀察①培養(yǎng)條件：

不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。（細菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d）②觀察：

每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果。（一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等）內(nèi)容現(xiàn)象結(jié)果分析是否有雜菌污染對照組培養(yǎng)基上無菌落生長對照組培養(yǎng)基上有菌落生長選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目明顯多余選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目樣品的稀釋操作是否成功得到2個或2個以上的菌落數(shù)為30—300個平板重復(fù)組的結(jié)果若選取的是同一個土樣，統(tǒng)計的結(jié)果應(yīng)該

培養(yǎng)基未被雜菌污染培養(yǎng)基被雜菌污染選擇培養(yǎng)基具有選擇作用操作成功接近（5）結(jié)果與分析可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色環(huán)帶，紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強。（5）進一步探究——分解尿素細菌的進一步鑒定①原理：

細菌合成的脲酶將尿素分解為氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，

pH升高，因此可以通過檢測培養(yǎng)基pH的變化來判斷是否發(fā)

生了該化學(xué)反應(yīng)，進而判斷該菌是否為尿素分解細菌。②方法：

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某

種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅：液體培養(yǎng)基：可以直接看液體的變色情況；固體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基：根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求配置。：加入能與目的菌的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色

反應(yīng)的指示劑。（作用）平板劃線法稀釋涂布平板法純化原理接種工具單菌落的獲得通過連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋程度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)，以得到單菌落接種環(huán)涂布器從最后劃線的區(qū)域挑?、俜蛛x純化菌種，獲得單菌落②用于計數(shù)兩種純培養(yǎng)方法的比較平板劃線法稀釋涂布平板法用途接種效果圖