任務3破傷風疫苗（破傷風類毒素）生產(chǎn)技術(shù)

學習情境一

預防性疫苗的生產(chǎn)

生物工程學院任務4破傷風疫苗生產(chǎn)技術(shù)知識目標（1）了解破傷風桿菌及其毒素；（2）掌握種子菌夜的培養(yǎng)；（3）掌握產(chǎn)毒培養(yǎng)基的配置；（4）掌握吸附過程；（5）掌握濃縮和精制過程；（6）掌握破傷風毒素生產(chǎn)工藝；能力目標（1）培養(yǎng)學生對疫苗的認知能力；（2）培養(yǎng)學生的觀察、分析、鑒別、總結(jié)歸納能力；（3）培養(yǎng)學生的團結(jié)協(xié)作能力；（4）鍛煉學生的動手能力。素質(zhì)目標（1）培養(yǎng)良好學習態(tài)度，注重項目操作細節(jié)；（2）遵守操作規(guī)程，愛護儀器設備；（3）樹立安全意識，保護自身和同學人身安全。“項目導向-任務驅(qū)動”教學法?！敖虒W做一體”教學法。“演示性”教學法?！耙龑?自主學習”教學法。24教學方法13培養(yǎng)產(chǎn)毒和收獲毒素濃縮和精制重點難點

任務1：雜交瘤細胞生產(chǎn)抗體技術(shù)任務導入：1.大家聽說過破傷風病嗎？2.破傷風毒素是怎么回事？3.那么我們?nèi)绾蝸磉M行破傷風毒素的生產(chǎn)呢？1任務講解2學生利用已有的知識制定具體的生產(chǎn)方案3學生以小組為單位分析工作任務，并制定具體的方案，還要小組進行具體的分工。教師示范和講解41、具體生產(chǎn)流程：

（1）菌種應選用產(chǎn)毒散價高、免疫力強的破傷風菌株。國內(nèi)使用的生產(chǎn)菌株為羅馬尼亞L58株，菌號64008株。（2）產(chǎn)毒培養(yǎng)基

現(xiàn)國內(nèi)多采用以蛋白質(zhì)水解液為基礎，再添加氨基酸及維生素等，在維持定的產(chǎn)毒水平下，適當加深水解．同時加人少量的甘油及炭末．以增加厭氧環(huán)境、穩(wěn)定毒素和吸附培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，從而提高產(chǎn)毒水平獲取高價毒素。2、技術(shù)操作要點：（3）培養(yǎng)產(chǎn)毒和收獲毒素

一般采用培養(yǎng)罐深層培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加炭末、甘油等以利破傷風菌生長和產(chǎn)毒。在培養(yǎng)過程中利用平壓通氣的方法排出破傷風菌生長過程中產(chǎn)生的H2S和CO2氣體。培養(yǎng)溫度必須嚴格控制存34℃，高于35℃或低于32℃產(chǎn)毒水平都會大幅度下降。破傷風毒素在細菌細胞內(nèi)合成產(chǎn)生，到培養(yǎng)后期才通過菌膜滲透或菌體裂解釋放到培養(yǎng)基中。所以經(jīng)培養(yǎng)5～6天后產(chǎn)毒達到高峰。利用除菌過濾的方法將培養(yǎng)物中菌體分離即可獲得含有破傷風毒素的濾液。（4）脫毒收獲的毒素經(jīng)脫毒后即為類毒素。脫毒一般用0.3％～0.4％的甲醛液。此外，pH、溫度及脫毒時間等均影響脫毒效果。所以要選擇適當條件，既能盡快脫毒，不發(fā)生毒素逆轉(zhuǎn)，叉能減少抗原性的損失?，F(xiàn)采用加入0.36％的甲醛、pH中性、37℃脫毒30天。（5）濃縮和精制一般采用超濾濃縮與硫酸銨沉淀相結(jié)合的方法精制破傷風毒素。即超濾、硫酸銨沉淀、超濾三步法。可有效地提高破傷風類毒素的制品質(zhì)量。第一步：超濾濃縮用50000MW中空纖維超濾器將原制類毒素濾液濃縮50～70倍。同時將濾液所含的大分子水解產(chǎn)物去除。第二步：硫酸銨分段沉淀第一階段沉淀，以0.16g／ml計算，將固體硫酸銨溶解于經(jīng)稀釋的濃縮液中，靜置過夜，以帆布過濾，濾清后將沉淀廢棄。第二階段沉淀，以上述濾過液按0.10g/ml左右加入硫酸銨，溶解后．靜置過夜．以帆布過濾，濾清后將濾液廢棄，沉淀用注射用水溶解并做澄清過濾。第三步：超濾透析將上述濾液用注射用水適當稀釋，循環(huán)超濾除去溶液中的硫酸銨，以最終硫酸銨含量低于0.001g／ml為合格。（6）除菌過濾將精制類毒素稀釋、調(diào)整到適當濃度(即萬分之一硫柳汞、085％NaCI)，用5％的NaOH調(diào)pH至6.8～7.2。使用0.22μm的微孔濾膜，除菌過濾分裝。（7）吸附精制破傷風類毒素的制備將類毒素吸附于Al(OH)3以增強類毒素的免疫效果和減輕接種副反應。精制類毒素的吸附：在無菌條件下，按7Lf/ml精制類毒素加入吸附劑中，補加1％的硫柳汞防腐劑，使其最終含量為1/10000。同時補加1/15mol/L，pH6.6磷酸鹽緩沖液，使其含量達到1/300mol/L,攪拌均勻后分裝。任務下達訓練5分組操作：學生分組實踐破傷風毒素這一工作任務，教師根據(jù)學生出現(xiàn)的問題進行有側(cè)重點的示教操作，指出并解釋操作中的重點和難點。學生再練習，教師巡回指導，糾正學生操作上的錯誤，并隨時解答學生的疑難問題。（隨堂打分：自我學習能力及操作技能。）

結(jié)果展示教師點評并