種子的擴大培養(yǎng)

關于種子的擴大培養(yǎng)指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的菌種接入試管斜面活化后，再經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定發(fā)酵產量高、數量充足、無污染的生產菌種的過程。第一節(jié)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子擴大培養(yǎng)第2頁,共48頁，2024年2月25日，星期天種子擴培的目的

接種量的需要

菌種的馴化

縮短發(fā)酵時間、保證生產水平第3頁,共48頁，2024年2月25日，星期天作為種子的準則細胞生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；生理性狀穩(wěn)定；菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無雜菌污染；保持穩(wěn)定的生產能力。第4頁,共48頁，2024年2月25日，星期天4.1種子的制備工藝第5頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共48頁，2024年2月25日，星期天實驗室階段：所用的設備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設備，在工廠中培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成。生產車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理。第7頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共48頁，2024年2月25日，星期天一、實驗室種子的制備一般采用兩種方式：對于產孢子能力強及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子。對于產孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法，獲得菌絲體，作為種子。

第9頁,共48頁，2024年2月25日，星期天①、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5

瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時

對于不產孢子和孢子發(fā)芽慢的微生物——獲得一定數量和質量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。第10頁,共48頁，2024年2月25日，星期天②.一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，

K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基

對于不產孢子和孢子發(fā)芽慢的微生物第11頁,共48頁，2024年2月25日，星期天③.二級種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%(10%)），32℃培養(yǎng)7-10個小時培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基第12頁,共48頁，2024年2月25日，星期天④種子的質量要求：108-109個/ml大小均勻，呈單個或八字排列PH7.0-7.2時結束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛第13頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

獲得一定數量和質量的孢子

與菌絲體培養(yǎng)相比步驟少，因而更容易獲得量和質穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。

對于產孢子的微生物

獲得一定數量和質量的菌絲體便于操作，但需要更仔細的控制。第14頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2、培養(yǎng)基選擇的原則

有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應該是有利于孢子的生長。

在原料方面，實驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細。第15頁,共48頁，2024年2月25日，星期天二、生產車間種子制備

種子罐的培養(yǎng)基成分原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。第16頁,共48頁，2024年2月25日，星期天1、培養(yǎng)物的選擇原則在生產車間階段，最終一般都是獲得一定數量的菌絲體。

縮短發(fā)酵時間

有利于獲得好的發(fā)酵結果菌絲體比孢子要有利：第17頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數量和質量的菌體，培養(yǎng)基首先考慮有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實驗室階段那么精細，基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基:

一是成本二是馴化第18頁,共48頁，2024年2月25日，星期天例：檸檬酸發(fā)酵

以蔗糖為原料成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%瓊脂2%第19頁,共48頁，2024年2月25日，星期天3、種子罐的作用：使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產物的合成。第20頁,共48頁，2024年2月25日，星期天種子罐級數：指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數，取決于：菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；所采用發(fā)酵罐的容積

4、種子罐級數的確定

第21頁,共48頁，2024年2月25日，星期天谷氨酸：三級發(fā)酵一級種子（搖瓶）→二級種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵一級種子（小罐）→二級種子（中罐）→發(fā)酵

一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數，但有時工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數第22頁,共48頁，2024年2月25日，星期天發(fā)酵級數確定的依據

級數受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響

級數大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。

在發(fā)酵產品的放大中，反應級數的確定是非常重要的一個方面第23頁,共48頁，2024年2月25日，星期天細菌：生長快，種子用量比例少，級數也較少，二級發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵孢子懸浮液→一級種子罐（27?C,40小時孢子發(fā)芽，產生菌絲）→二級種子罐（27?C,10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子第24頁,共48頁，2024年2月25日，星期天種子級數越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會種子級數太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產率，增加染菌機會雖然種子罐級數隨產物的品種及生產規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級數。

確定種子罐級數需注意的問題第25頁,共48頁，2024年2月25日，星期天5、接種量的確定

移入種子的體積接種量＝—————————

接種后培養(yǎng)液的體積接種量過多，菌絲生長過快、溶氧不足，衰老細胞增加等，發(fā)酵后勁不足種量過少延長發(fā)酵周期，形成異常形態(tài)，而且易造成染菌。以生產菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度為依據接種量的大小直接影響發(fā)酵周期。第26頁,共48頁，2024年2月25日，星期天雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數抗生素為7-15%。但是一般認為大一點好。第27頁,共48頁，2024年2月25日，星期天采用被孢霉進行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體接種量對菌體形態(tài)和產Υ亞麻酸的影響楊博，中國油脂，2002第28頁,共48頁，2024年2月25日，星期天研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體的形態(tài)，從而影響菌體干重和Υ亞麻酸產量。第29頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

不同接種量影響菌體的生長和發(fā)酵第30頁,共48頁，2024年2月25日，星期天發(fā)酵前期發(fā)酵液作為種子，發(fā)酵指數明顯提高發(fā)酵后期菌體自溶明顯，影響提煉收率第31頁,共48頁，2024年2月25日，星期天20%種子罐＋10%發(fā)酵罐前期發(fā)酵液效果最好第32頁,共48頁，2024年2月25日，星期天6、種齡指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結果定。第33頁,共48頁，2024年2月25日，星期天大量地接入培養(yǎng)成熟的菌種的優(yōu)點：縮短生長過程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵周期，提高了設備利用率節(jié)約發(fā)酵培養(yǎng)的動力消耗有利于減少染菌機會第34頁,共48頁，2024年2月25日，星期天舒琴，林產化學與工業(yè)，2004鏡檢：24小時多個桿菌首位相連成線形，處于繁殖旺盛期

30小時開始出現(xiàn)芽孢第35頁,共48頁，2024年2月25日，星期天4.2影響種子質量的因素原材料質量培養(yǎng)溫度濕度通氣與攪拌斜面冷藏時間培養(yǎng)基pH第36頁,共48頁，2024年2月25日，星期天原材料質量原材料質量波動引起種子質量不穩(wěn)定原材料質量波動的主要原因：無機離子含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也會影響孢子的質量）。第37頁,共48頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)溫度溫度過低，菌種生長發(fā)育緩慢溫度過高會使菌絲過早自溶在制備土霉素生產種子過程中，高于37℃培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后表現(xiàn)出糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。第38頁,共48頁，2024年2月25日，星期天濕度濕度低，孢子生長快；濕度大，孢子生長慢制備土霉素生產菌種龜裂鏈霉菌孢子時發(fā)現(xiàn)，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干癟狀，孢子稀少第39頁,共48頁，2024年2月25日，星期天通氣與攪拌足夠的通氣量，以保證菌種代謝正常，提高種子的質量攪拌可提高通氣效果，促進生長繁殖，過度攪拌導致培養(yǎng)液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化變性，泡沫過多增加染菌機會，增加能耗。絲狀微生物不宜劇烈攪拌。第40頁,共48頁，2024年2月25日，星期天斜面冷藏時間對孢子的生產能力有較大影響冷藏時間越長，生產能力下降越多鏈霉素生產中，斜面孢子在6℃冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月的降低18％，比冷藏3個月的降低35％。第41頁,共48頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基培養(yǎng)種子的目的：擴大培養(yǎng)，增加細胞數量；同時也必須培養(yǎng)出強壯、健康、活性高的細胞。為了使細胞迅速進行分裂或菌絲快速生長。第42頁,共48頁，2024年2月25日，星期天有較完全和豐富的營養(yǎng)物質，糖分少，需充足氮源和生長因子，無機氮源比例大；各種營養(yǎng)物質的濃度不必太高；供孢子用的種子培養(yǎng)基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源；應考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近。種子培養(yǎng)基特點第43頁,共48頁，2024年2月25日，星期天pH選擇最適種子培養(yǎng)pH的原則是獲得最大比生長速率和適當的菌量培養(yǎng)最