菌種的選育保存和復(fù)蘇

關(guān)于菌種的選育保存和復(fù)蘇第一節(jié)菌種的分離一、菌種的來(lái)源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購(gòu)買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。

第2頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來(lái)。實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。第3頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟。到目前為止，還沒(méi)有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個(gè)試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類。在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；在工業(yè)微生物篩選過(guò)程中，應(yīng)及時(shí)調(diào)整檢測(cè)方法，以與各種不同類型的生長(zhǎng)和代謝之微生物相適應(yīng)。因此，建立一更為科學(xué)的和針對(duì)性不強(qiáng)的分離方法是必要的。

二、分離思路

第4頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）成功的分離培養(yǎng)方法(1)認(rèn)真考慮所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過(guò)程；(2)制訂初步的篩選標(biāo)準(zhǔn)；(3)將生態(tài)學(xué)方法運(yùn)用到分離和篩選過(guò)程。第5頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）培養(yǎng)分離中要解決的問(wèn)題1、“分離什么和從哪里分離出?”2、必須充分考慮所分離微生物的生產(chǎn)能力、生長(zhǎng)速度、生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其提純的難易和費(fèi)用，工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等。3、選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測(cè)方法。第6頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離的

一般思路要點(diǎn)1、羅列出所要分離的微生物類群；2、根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù)，描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地：3、將若干樣本分成若干類型，如植物和植物各部，土壤(類型和土層)、巖石、水、昆蟲和發(fā)酵食品等；4、羅列出所要考察和測(cè)量的環(huán)境參數(shù)，如pH、鹽分、水分、氧化還原電勢(shì)及溫度等；第7頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠；6、根據(jù)上述1-5項(xiàng)中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件；7、用標(biāo)準(zhǔn)方法作對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)生態(tài)學(xué)分離方法；8、根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法；9、運(yùn)用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。第8頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性。采樣：有針對(duì)性地采集樣品。增殖：人為地通過(guò)控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測(cè)定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營(yíng)養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長(zhǎng)和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟第9頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

（一）采樣1、采樣對(duì)象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過(guò)的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對(duì)象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。第10頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天從自然界篩選第11頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。第12頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）增殖培養(yǎng)

為了容易分離到所需的菌種，讓無(wú)關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過(guò)配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來(lái)控制。

例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng)，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多。

厭氧或好氧、酸堿度的選擇、特殊的生理特性、添加特殊的抑制劑第13頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）培養(yǎng)分離

盡管通過(guò)增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。第14頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）篩選

這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過(guò)三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。第15頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天（五）毒性試驗(yàn)

自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國(guó)家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無(wú)須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過(guò)兩年以上的毒性試驗(yàn)。第16頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

(一)采樣和采集方法為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細(xì)菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時(shí)，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時(shí)所需的工具通常有無(wú)菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無(wú)菌小塑料袋和塑料瓶等。四、實(shí)例——自然界中細(xì)菌的分離第17頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天采樣的注意事項(xiàng)1、采樣時(shí)應(yīng)盡可能保持相對(duì)無(wú)菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期、地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時(shí)間因素，因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的；第18頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、采好的樣應(yīng)及時(shí)處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4℃下，但貯存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。這是因?yàn)橐坏┎蓸咏Y(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來(lái)的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會(huì)發(fā)生變化，微生物群體之間就會(huì)出現(xiàn)消長(zhǎng)。第19頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天1．土樣采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴(yán)格，可取離地面5～15cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根際土樣時(shí)，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量無(wú)菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無(wú)菌水漂洗下根部殘留的土，這部分上卻為根際土樣。第20頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天2．植物體采集方法在采集葉面時(shí)，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。選擇葉面時(shí)應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。采集植物根及根系時(shí)，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時(shí)，一般與根際土樣一起保存。第21頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

3．水樣采集方法用于細(xì)菌檢測(cè)的水樣應(yīng)收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，故在采樣時(shí)應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開(kāi)瓶蓋，讓水樣進(jìn)入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時(shí)應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測(cè)，或者4℃下貯存。第22頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天(二)生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基

的組成原則1、加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量、環(huán)境生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中所要分離的細(xì)菌的數(shù)量和種類。2、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。第23頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50μg／m1，以抑制真菌的生長(zhǎng)。4、瓊脂平板在使用前應(yīng)置于37℃培養(yǎng)箱中孵育l、2天。5、培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。第24頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）土中細(xì)菌的富集培養(yǎng)與分離

分離土樣中的大部分細(xì)菌的分離程序中無(wú)需進(jìn)行富集。但對(duì)某些少數(shù)細(xì)菌則要求特殊的富集或選擇技術(shù)才能很好地被分離培養(yǎng)。第25頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天富集方法運(yùn)用細(xì)菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長(zhǎng)因子的前體物質(zhì)來(lái)激活細(xì)菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。富集可以促進(jìn)抗性的產(chǎn)生并維持下來(lái)。第26頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天土樣中細(xì)菌的富集：適度稀釋后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如幾丁質(zhì)、纖維素等)的土浸出汁平板。植物體上細(xì)菌的分離：無(wú)菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。水中細(xì)菌的分離：水樣通過(guò)0.22μm無(wú)菌濾膜，取出濾膜用1ml無(wú)菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。用樣本稀釋液適度稀釋,涂布平板倒置培養(yǎng)或?yàn)V紙壓印分離法。第27頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天水中細(xì)菌分離的簡(jiǎn)易富集技術(shù)在無(wú)菌的、用棉團(tuán)塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng)，定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上；在不同水體的水樣中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白質(zhì)等，同樣可以促進(jìn)水中微生物的增殖。培養(yǎng)過(guò)程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長(zhǎng)。另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細(xì)菌“附著材料”，如無(wú)菌的植物組織或土壤浸出液。通過(guò)改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細(xì)菌、中溫菌和嗜高溫菌。第28頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天次代培養(yǎng)及純化步驟涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后，如生長(zhǎng)出菌落，則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對(duì)瓊脂平板進(jìn)行分類。用無(wú)菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上及轉(zhuǎn)接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上。篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后，按生長(zhǎng)出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素、菌落形態(tài)等進(jìn)行最初分組。將認(rèn)為有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進(jìn)行篩選。第29頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天生產(chǎn)選種

在長(zhǎng)年累月的生產(chǎn)實(shí)踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒(méi)有任何可見(jiàn)變更情況下，突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大，這就有可能是個(gè)別自然變異朝更好的方向變的細(xì)胞，在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，這種優(yōu)勢(shì)的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。進(jìn)行類似新種篩選分離，達(dá)到獲得新的優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的。第30頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)工業(yè)菌種的育種方針工業(yè)菌種的育種：是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對(duì)某個(gè)用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造。通過(guò)改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強(qiáng)化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。第31頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天工業(yè)菌種育種的方法誘變基因轉(zhuǎn)移基因重組第32頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天育種過(guò)程包括下列3個(gè)步驟：

(1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。

(2)希望基因型的選出。

(3)改良菌種的評(píng)價(jià)(包括實(shí)驗(yàn)規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)。第33頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天選擇育種方法時(shí)綜合考慮的因素(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn))；(2)對(duì)這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬(wàn)面認(rèn)識(shí)的明了程度；(3)經(jīng)濟(jì)費(fèi)用。如果對(duì)特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機(jī)誘變、篩選及選育等技術(shù)：如果對(duì)其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識(shí)，則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種。第34頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天工業(yè)菌種改良方法(1)解除或繞過(guò)代謝途徑中的限速步驟：通過(guò)增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來(lái)提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個(gè)旁路代謝途徑。(2)增加前體物的濃度。(3)改變代謝途徑，減少無(wú)用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對(duì)高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。第35頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。(5)改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。第36頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

提高特定基因的表達(dá)水平引入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)，可通過(guò)在一高效表達(dá)載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強(qiáng)啟動(dòng)子；修改現(xiàn)有表達(dá)信號(hào)，提高基因效力等。誘導(dǎo)解除基因表達(dá)抑制的突變。第37頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

改進(jìn)菌種的生長(zhǎng)效率通過(guò)確定并改變代謝中的耗能部分;由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)。賦予菌種對(duì)多種底物，特別是價(jià)廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費(fèi)用。提高菌株對(duì)底物的利用率方法：第38頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指通過(guò)誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分才能正常生長(zhǎng)的變異株。與營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型。一、基本概念第39頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天能滿足野生型菌株正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分的稱補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)；能滿足各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。第40頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途

營(yíng)養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。第41頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備淘汰野生型檢出缺陷型確定生長(zhǎng)譜第42頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天(一)出發(fā)菌株的選擇1、自然界新分離的野生型菌株，對(duì)誘變處理較敏感，容易達(dá)到好的效果。2、在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3、每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4、出發(fā)菌株開(kāi)始時(shí)可以同時(shí)選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。第43頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

5、要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來(lái)作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。

6、根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因?yàn)橥徽T變劑的重復(fù)處理會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，就要選對(duì)數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。第44頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

(二)處理菌懸液的制備

這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過(guò)濾。第45頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）誘變方法物理誘變化學(xué)誘變

根據(jù)有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對(duì)象的實(shí)際，設(shè)計(jì)誘變處理方案。第46頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生長(zhǎng)，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時(shí)讓野生型生長(zhǎng)，處于活化階段，而缺陷型無(wú)法生長(zhǎng)，仍處于休眠狀態(tài)。由于細(xì)菌或酵母對(duì)一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細(xì)菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過(guò)濾法：對(duì)于霉菌，因孢子生長(zhǎng)后會(huì)長(zhǎng)出菌絲體，就可用濾紙過(guò)濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過(guò)。第47頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

（五）檢出缺陷型原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)情況完全不同，缺陷型在CM上生長(zhǎng)良好，而在MM上則不生長(zhǎng)，野生型都能生長(zhǎng)。

具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法

第48頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、將一較平且直徑小于1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。2、將完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位。3、將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。

1、影印法第49頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。5、二平皿相同方位進(jìn)行比較，即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長(zhǎng)出的菌落少于CM平板上的。MM上未長(zhǎng)而相應(yīng)于CM上長(zhǎng)出的那幾個(gè)菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。第50頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

2、點(diǎn)種法也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長(zhǎng)出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況。此法結(jié)果明確，但工作量大。第51頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

3、夾層法先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時(shí)第二批長(zhǎng)出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點(diǎn)是，結(jié)果有時(shí)不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。第52頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)譜的確定

驗(yàn)證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷因子，即生長(zhǎng)譜測(cè)定。第53頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天生長(zhǎng)譜測(cè)定的方法

將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細(xì)胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5～6個(gè)區(qū)間放上不同的營(yíng)養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營(yíng)養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會(huì)在某組合區(qū)長(zhǎng)出，就可測(cè)得所需營(yíng)養(yǎng)。—個(gè)平皿測(cè)一個(gè)菌。第54頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

以不同組合的營(yíng)養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個(gè)缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長(zhǎng)出可推知其營(yíng)養(yǎng)因子。在5～6個(gè)平皿上可測(cè)20株菌以上。第55頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)基因育種1、基因重組育種：運(yùn)用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過(guò)細(xì)胞間的相互作用，使一個(gè)細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另—個(gè)細(xì)胞的方法。第56頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、一個(gè)完整的基因克隆過(guò)程包括以下步驟１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；４、篩選、鑒定陽(yáng)性重組子；５、重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá)。第57頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因重組第58頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天載體－宿主系統(tǒng)

載體(vector)：是攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的DNA；一般是通過(guò)改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。第59頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天載體應(yīng)具備以下條件：１、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制；２、具有多種限制酶的單一切點(diǎn)（即所謂多克隆位點(diǎn)）以便外源DNA插入；３、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽(yáng)性與陰性重組分子；４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時(shí)載體DNA與宿主DNA便于分離；５、對(duì)于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等基因表達(dá)元件。第60頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天宿主細(xì)胞必須符合以下條件１、對(duì)載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒(méi)有嚴(yán)格的限制；２、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；３、在重組DNA增殖過(guò)程中，不會(huì)對(duì)它進(jìn)行修飾；４、重組缺陷型，不會(huì)產(chǎn)生體內(nèi)重組；５、容易導(dǎo)入重組DNA分子；６、符合重組DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。第61頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天第五節(jié)雜交育種第62頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

一、細(xì)菌雜交在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)雜交的種類尚不多，主要是大腸桿菌，其他還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒(méi)有F因子稱F-。F因子存在于細(xì)胞中形式：游離狀態(tài)(F+細(xì)胞)；整合狀態(tài)，即F因子插入胞核質(zhì)的一定位置上(Hfr細(xì)胞)。F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，實(shí)質(zhì)上是F因子的轉(zhuǎn)移，所以F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌。第63頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、酵母雜交育種技術(shù)1、酵母繁殖方式酵母為單細(xì)胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情況下，繁殖體為雙倍體，但經(jīng)過(guò)特定條件的誘導(dǎo)，可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體。第64頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天單倍體細(xì)胞具α及ε2兩種交配型。兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配，恢復(fù)為雙倍體；同一交配型細(xì)胞之間，則因細(xì)胞壁上凝集因子的存在而不能進(jìn)行交配。在生活過(guò)程中，酵母細(xì)胞還可以形成三倍體、四倍體、多倍體或非整倍體細(xì)胞。第65頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、酵母雜交一般而言，雜交育種運(yùn)用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對(duì)的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。酵母的雜交方法有孢子雜交法、群體交配法、單倍體細(xì)胞雜交法和罕見(jiàn)交配法。就啤酒酵母而言，運(yùn)用罕見(jiàn)交配法更易獲得結(jié)果。第66頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天第六節(jié)原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國(guó)際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)上提出來(lái)的。第67頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

一、原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn)1、雜交頻率較高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。2、受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。3、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的過(guò)程。第68頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、存在著兩株以上親株同時(shí)參與融合形成融合子的可能性。5、有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。6、提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。7、有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。第69頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、原生質(zhì)體融合育種步驟1、標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證。2、原生質(zhì)體制備。3、等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合。4、涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5、選擇性培養(yǎng)基上劃線生長(zhǎng)，分離驗(yàn)證，挑取融合子進(jìn)一步試驗(yàn)、保藏。6、生產(chǎn)性能篩選。第70頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

三、原生質(zhì)體融合育種的要點(diǎn)1、標(biāo)記菌種的選擇獲得標(biāo)記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營(yíng)養(yǎng)缺陷型或／和抗藥性菌株。這里最重要的是標(biāo)記必須穩(wěn)定。采用抗藥性菌株除可作標(biāo)記外，在實(shí)驗(yàn)室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標(biāo)記菌種。第71頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細(xì)胞壁分解酶，將細(xì)胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細(xì)胞，它保持原細(xì)胞的一切活性。在放線菌和細(xì)菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。第72頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

四、影響原生質(zhì)體制備的因素1、菌體的前處理為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細(xì)菌加入亞抑制劑量的青霉素。2、菌體的培養(yǎng)時(shí)間為了使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。3、酶濃度對(duì)于不同種屬的微生物，不僅對(duì)酶的種類要求不同，就是對(duì)酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨不同的生長(zhǎng)期的菌體而變化。第73頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、酶處理溫度5、破壁時(shí)的pH值6、滲透壓穩(wěn)定劑等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機(jī)物和KCl和NaCl等無(wú)機(jī)物。第74頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天第七節(jié)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長(zhǎng)期保藏，對(duì)于一成功的工業(yè)發(fā)酵過(guò)程極為重要。第75頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件(1)

經(jīng)長(zhǎng)期保藏后菌種存活健在；(2)

保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。(3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。第76頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

1、冷凍干燥或真空干燥保藏；2、超低溫或在液氮中冷凍保藏；3、轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?、土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。第77頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、冷凍保藏

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡(jiǎn)單而有效的方法。通過(guò)冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑。冷凍保藏時(shí)溫度要求在-20℃以下，同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。第78頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天冷凍保藏種類

一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)三、液氮冷凍保藏技術(shù)

第79頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中?；蛘?，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長(zhǎng)適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。第80頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天應(yīng)注意的是經(jīng)過(guò)一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來(lái)保藏。保藏過(guò)程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡(jiǎn)便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏。第81頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)

要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進(jìn)行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：

1．離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞；

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；

3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。第82頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天

如果待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過(guò)此保藏方法保藏5年而活力不受影響。第83頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天液氮冷凍保藏技術(shù)

(一)冷凍保護(hù)劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過(guò)濾滅菌。

第84頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟

1、待冷凍保藏菌種懸液的制備

(1)從生長(zhǎng)斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5～lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，

第85頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)從浸沒(méi)培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒(méi)培養(yǎng)液中加入等體積20%無(wú)菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。第86頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、控速冷凍

(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；

(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；

(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30℃)；

(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變；第87頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達(dá)-50℃；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96℃)或氣相(-156℃)中保存。如果無(wú)控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。第88頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天(三)復(fù)蘇

1、從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中。

2、迅速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動(dòng)以加速解；

3、用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有

2m1無(wú)菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml(約4、8滴)

轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。第89頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、凍干保藏

冷凍干燥的基本方法：是通過(guò)在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長(zhǎng)期保藏的最為有效的方法之一。冷凍干燥過(guò)程中必須使用冷凍保護(hù)劑，目前國(guó)內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國(guó)外尚有運(yùn)用動(dòng)物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。第90頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)物的凍干過(guò)程第91頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天(二)操作步驟1．啟動(dòng)冷凍干燥器的致冷單元。當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到-40℃時(shí)啟動(dòng)真空泵，使真空度達(dá)到2.67～4.00Pa。2．將冷凍槽置于歧管之下方。槽中裝入2／3體積的異丙醇，然后插入溫度計(jì)及可調(diào)溫控儀降溫探頭．打開(kāi)降溫探頭控制醇浴溫度在-40℃，這—過(guò)程約需30min。3．每支斜面加入2ml20％的脫脂乳，然后用巴氏吸管將斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌體均懸液，最終菌株濃度一般要求在106CFU／m1．用細(xì)菌浸沒(méi)培養(yǎng)物來(lái)保藏時(shí)，加入40％的脫脂乳，混合制成含106CFU／ml的均懸液。第92頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天4．取下安瓿上的棉塞，然后用lml移液管分裝安瓿(0.2ml／瓿)，重新塞好棉塞。5．輕輕振蕩安瓿，以使細(xì)胞重新懸浮。將安瓿與歧管相聯(lián)后迅速置于醇浴中，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使細(xì)胞懸液迅速凍結(jié)。第93頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天6．15min后，將歧管與真空泵相通。7．維持-40℃的醇浴溫度90-120min，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使醇浴溫度上升至-10℃，維持2h。8．關(guān)掉可調(diào)溫控裝置的降溫探頭，讓醇浴溫度上升至室溫(25℃)．9．在冷凍干燥的最初4h內(nèi)應(yīng)定期測(cè)真空度，在安瓿置于真空下后1h內(nèi)，真空度必須達(dá)到13.33Pa，并于菌懸液接近干燥時(shí)逐漸降到2.67～4.0Pa。第94頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天10．在真空狀態(tài)下，讓安瓿保存在冷凍干燥機(jī)中至少16h以獲得完全干燥。11．干燥后，在2.67～4.00Pa的真空度下封瓶．12．在所有安瓿都封蓋好后，撤去真空。13．關(guān)閉真空泵。14．關(guān)閉冷凝器。第95頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、凍干菌種的保藏與再生1、保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對(duì)于培養(yǎng)物的長(zhǎng)期穩(wěn)定更好。2、復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺(tái)中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無(wú)菌紗布或無(wú)菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開(kāi)安瓿．第96頁(yè),共108頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)在安瓿中加入0.5～1ml營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，